奥地利OROBOROS细胞能量代谢分析仪

德国INCYTON实时全息多参数细胞能量代谢分析平台

 

产品中心

生物体能量代谢在脑科学研究中具有引导性定位,在分子、细胞水平的神经科学中,包括阿兹海默症的病理学和认知、线粒体自噬与神经毒性、树突状细胞与脂肪酸合成、线粒体氧化磷酸化与脑损伤恢复等等多个方面,可以多角度/多方向研究脑科学、神经科学的病理与治疗,为脑科学研究者提供更专业的研究平台。

探索生命的力量

 

各复合物在氧化磷酸化过程中的功能角色1

 

 

 

复合物I( complex I)

复合物I( complex I):即NADH-CoQ还原酶,又称NADH脱氢酶。哺乳动物的复合物I作为电子进入呼吸链的起始点,在整个氧化磷酸化反应过程中发挥着至关重要的作用,其功能障碍会引起细胞呼吸作用至少40%的衰减,进而导致多种疾病,诸如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、嗜酸细胞型腺瘤、遗传性视神经病变、婴儿致死性线粒体病、Leigh综合征、糖尿病以及肥厚型心肌病等。

 

复合物II( complex II)

复合物II( complex II):琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一,可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子,其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。琥珀酸脱氢酶的突变和异常往往与多种疾病有关,常见包括:副神经节瘤(PGL)和嗜铬细胞瘤(PHEO)、胃肠道间质瘤 (GIST)、肾细胞癌、 Leigh综合征等。

 

复合物III( complex III)

复合物III( complex III):复合物Ⅲ又称CoQH2-细胞色素c 还原酶复合物, 总相对分子质量为250kDa。通过将细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)和复合物分析技术相结合获得的信息表明,CIII在SC形成中作为整个呼吸链生物发生的结构和功能平台具有新的主要作用。CIII的功能缺陷将引起肺动脉高压、人类CIII缺陷症、 GRACILE综合征、脑病、Leber 遗传性视神经病变、心肌病和肌病等。

 

复合物IV( complex IV)

复合物IV( complex IV):复合物Ⅳ又称细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase)。复合物IV代表线粒体呼吸链的限速酶,其活性是细胞氧化能力的指标。因此,它注定是调节氧化磷酸化,质子泵送效率,ATP和活性氧产生的中心位点,这反过来又影响细胞信号传导和存活,复合物IV的缺陷已被证明会导致许多疾病,包括Leber遗传性视神经病变,Leigh综合征,复发性肌红蛋白尿线粒体疾病,耳聋感音神经性线粒体疾病和结直肠癌、年龄依赖性肥胖、新生儿呼吸窘迫综合征、亨廷顿舞蹈症等。

线粒体是如何产生能量的

 

各复合物在氧化磷酸化过程中的功能角色2

 

 

 

 

线粒体复合物V或ATP合酶

线粒体复合物V或ATP合酶是一种酶复合物,作为分子机器在线粒体呼吸过程的最后一步在细胞中产生和水解ATP。因此,ATP合酶不仅在维持细胞能量状态方面起着关键作用,而且在决定线粒体呼吸功能方面也起着关键作用。 ATP合酶活性失调应对线粒体呼吸产生重大影响,从而影响心脏、神经系统的表现。例如:靶向 ATP 合酶调控作为心脏疾病的治疗靶点、线粒体ATP合酶的失调和功能障碍已成为阿兹海默症的细胞标志之一, ATP合酶能够调节能量代谢并调节导致ROS形成,细胞死亡和存活的途径、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、帕金森病等.

 

NADH

NADH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD(+))是真核细胞中的一种中枢代谢辅因子,在调节细胞代谢和能量平衡方面起着重要作用。NAD(+)以其还原形式(即NADH)作为线粒体呼吸链的主要电子供体,参与氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。

 

辅酶Q(CoQ)

辅酶Q(CoQ)是一种重要的辅因子,主要存在于线粒体内膜上,在呼吸链中起电子载体的作用,也是一种亲脂性抗氧化剂。辅酶Q(10)缺乏症在临床和遗传上是异质性的。该综合征与五种主要临床表型有关:(1)脑肌病,(2)严重婴儿多系统疾病,(3)小脑性共济失调,(4)孤立性肌病,(5)肾病综合征。呼吸链缺陷、活性氧的产生和细胞凋亡在原发性辅酶Q(10)缺陷的发病机制中起着不同的作用。

 

 

 

能量代谢的检测往往与多方向的科研领域相关,传统的测量方法往往集中在细胞整体层面上能量表达的改变,而忽略了其能量代谢本质上是线粒体功能的缺失、数量的增减;Oroboros O2k高精度能量代谢分析系统针对细胞、组织内的线粒体功能,尤其是氧化磷酸化过程中的复合功能蛋白进行针对性检测,确定病变部位能量改变的真实作用靶点,纵向挖掘线粒体的本质变化。能量代谢研究常应用于肿瘤、肥胖、糖尿病、衰老、药理、毒理、运动、营养、遗传等多种研究领域。

      线粒体(mitochondria)是一种具有半自主性的细胞器(semiautonomous organ-els),它有自身独特的遗传系统。进行有氧呼吸的酵母、原生动物和高等动植物细胞都有线粒体,但很多哺乳动物的成熟红细胞却例外,它们的线粒体在红细胞发育成熟的过程中逐步退化消失。生物体内的生物合成、呼吸、分泌及机械运动等全部细胞活动所需要的化学能都是由线粒体提供的。通过十分复杂而又相互关联的一系列综合反应和电子传递,线粒体利用糖和脂肪酸氧化过程中所释放的自由能,将二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸转变为三磷酸腺苷(ATP)。线粒体至少具有70种以上的酶,这些酶按精确的顺序合理分布于线粒体的不同部位。这是生物学中结构与功能完美结合的一个突出实例。(摘自《线粒体医学与健康》)

OROBOROS O2k高分辨率细胞能量代谢分析系统

 

 

OROBOROS  O2k系统通过高分辨率的极谱氧电极和全功能的荧光技术实现对样本的线粒体呼吸功能以及生物体的能量代谢进行精准定量及分析。

O2k检测指标已经成为国际线粒体研究的标准,其应用范围几乎涉及所有与细胞或线粒体能量代谢相关的领域。

多功能参数检测:可同时检测pO2(耗氧率)、RCR(呼吸控制比率)、pH(产酸率)、MMP(线粒体膜电位)、ROS(活性氧)、ATP(三磷酸腺苷)、Ca2+(钙离子)、NO(一氧化氮)、H2S(硫化氢)、TPP+(四苯基膦)、NADH(辅酶Ⅰ)、CoQ(质体醌)、植物氧气释放速度等。

多种样品适用:可用于直接测量线粒体、原代细胞、传代细胞、组织器官、血液、微生物、植物细胞等。

 

核心主要性能特点:

双通道系统/多通道系统

测量样本容量0.5ml-3.5ml

温度范围:4-47℃,温度稳定性为±0.002℃,可进行低温试验、控温实验等

样本舱为杜兰玻璃材质,可反复利用,无使用耗材

配合样本舱的其他结构为钛金属等极低活性的材质,提高材质抗氧化性,增加使用寿命

具有可变速的磁力搅拌功能,对脂肪细胞等脆弱样本,可降低搅拌速度,确保样本无损伤

极谱氧电极传感器,耗氧率检测分辨率为1 pmol O2 · s-1 ∙ ml-1 

耗氧率稳定状态下5分钟内变化不超过0.5 pmol · s-1· ml-1

光学(荧光、可见光)检测单元,与耗氧率同步进行检测,同时可得到多种参数数据

独立外接电极单元:pH、H2O2、TPP+、H2S、NO、质体醌

荧光检测参数包括:MMP、ATP、Ca2+、ROS、NADH

检测参数可根据不同配置进行增配和减配,配置更灵活

具有标准曲线、单点、多点校准模式,其测量参数具有更高的可靠性

双通道微量注射泵,具有注射和回抽的功能,可编辑自动化控制

无限制加药次数,配有15种不同量程的微型加药针

专用组织匀浆工具,采用匀浆管技术对样本进行研磨,样本需求量少至几毫克

可特异性设计实验,根据实验设计实时加入不同的底物、抑制剂等化合物去改变线粒体的呼吸,最多可以加入20多种底物、抑制剂

强大的DatLab软件功能:可实时显示并记录所有测量参数;可在实验过程中随时更改实验设计;可自动进行耗氧率、光学等参数的校准

具有Protocol编程功能,支持客户自定义编程以便重复实验,同时厂家提供多种Protocol程序,方便客户选用

 

 

O2k-Fluo Smart-Module荧光检测模块: 

  1. 独立检测模块,无独立电源,配合O2k-FluoRespirometer型号使用
  2. 含有两套独立荧光检测器
  3. 可对四种参数检测,检测参数包括: MMP、ATP、Ca2+、ROS
  4. 两套独立荧光检测器包括绿色激发器525 nm(主波长)、蓝色激发器465nm(主波长)
  5. 可适用样本类型:纯化线粒体、细胞、组织、微生物等
  6. 配有专业升级版软件

 

 

NADH-Module 检测模块:

  1. 独立检测模块,配合NextGen-O2k使用
  2. 检测NADH的实时变化数据
  3. 由紫外激发光和NADH传感器组成
  4. 紫外激发光365nm
  5. 与耗氧率检测不冲突,可同时得到耗氧率以及NADH的数据
  6. 可适用于动物样本和植物样本

 

 

 

PB-Module 检测模块:

  1. 外部光源模块,配合NextGen-O2k主机使用
  2. 属于光生物光源模式
  3. 白色生物光源:发射波长425-750nm
  4. 蓝色生物光源:发射波长439-457nm
  5. 红色生物光源:发射波长620-632nm
  6. 光强度可调节范围:0-2750µmol*s-1*m-2(红色)、0-3000µmol*s-1*m-2(蓝色)、0-3500µmol*s-1*m-2(白色)
  7. 常用于植物叶片、藻类的测量

 

 

Q-Module 检测模块:

  1. 独立外置检测模块,配合NextGen-O2k主机使用
  2. 采用三电极检测体系
  3. 检测辅酶Q的氧化还原状态
  4. 使用Cyclic Voltammogram检测原理
  5. 最短采样间隔0.2s
  6. 可应用于动物样本和植物样本

O2k-Fluo Smart-Module荧光检测模块: 

  1. 独立检测模块,无独立电源,配合O2k-FluoRespirometer型号使用
  2. 含有两套独立荧光检测器
  3. 可对四种参数检测,检测参数包括: MMP、ATP、Ca2+、ROS
  4. 两套独立荧光检测器包括绿色激发器525 nm(主波长)、蓝色激发器465nm(主波长)
  5. 可适用样本类型:纯化线粒体、细胞、组织、微生物等
  6. 配有专业升级版软件

 

 

NADH-Module 检测模块:

  1. 独立检测模块,配合NextGen-O2k使用
  2. 检测NADH的实时变化数据
  3. 由紫外激发光和NADH传感器组成
  4. 紫外激发光365nm
  5. 与耗氧率检测不冲突,可同时得到耗氧率以及NADH的数据
  6. 可适用于动物样本和植物样本

 

 

 

PB-Module 检测模块:

  1. 外部光源模块,配合NextGen-O2k主机使用
  2. 属于光生物光源模式
  3. 白色生物光源:发射波长425-750nm
  4. 蓝色生物光源:发射波长439-457nm
  5. 红色生物光源:发射波长620-632nm
  6. 光强度可调节范围:0-2750µmol*s-1*m-2(红色)、0-3000µmol*s-1*m-2(蓝色)、0-3500µmol*s-1*m-2(白色)
  7. 常用于植物叶片、藻类的测量

 

 

Q-Module 检测模块:

  1. 独立外置检测模块,配合NextGen-O2k主机使用
  2. 采用三电极检测体系
  3. 检测辅酶Q的氧化还原状态
  4. 使用Cyclic Voltammogram检测原理
  5. 最短采样间隔0.2s
  6. 可应用于动物样本和植物样本

 

O2k检测模块

应用方法(一):

极谱氧电极高分辨率呼吸测量法评估细胞线粒体功能

关键词:活细胞、氧化压力测试、解偶联剂浓度逐级梯度滴加

 

 

 

 

实验中分别添加丙酮酸、谷氨酸、ADP、琥铂酸、鱼藤酮、寡霉素、FCCP、抗霉素等,实验结果显示线粒体在底物型试剂添加过程中其耗氧率随底物的添加产生变化,而活性氧的变化不明显。当抑制剂添加之后,明显可见活性氧产生积累,进而影响耗氧率的变化情况。 

参考文献:Gnaiger (2008) Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. in: Mitochondrial Dysfunction in Drug-Induced Toxicity. John Wiley.

应用方法(二):

极谱氧电极高分辨率呼吸测量法评估组织线粒体功能

关键词:活检肌肉组织、肌纤维透化、底物试剂无限制添加、高质量数据

 

 

 

实验样本为不同质量的人类股外侧肌组织,采用脂肪酸氧化(F),NADH途径(N)和琥珀酸途径(S)的底物的试剂滴加方案;将样本A 3.4mgWw组织与样本B 2.8mgWw 组织分别置于双通道的细胞代谢测量分析系统中,并分别加入苹果酸、辛酰肉碱、ADP、谷氨酸、琥珀酸、鱼藤酮、丙二酸、粘噻唑、以及抗霉素等,观察细胞的耗氧情况。红色曲线为样本A,绿色曲线为样本B,实验结果表明,活检肌纤维样本具有能量代谢测量的可操作性,且不同质量样本归一化结果具有可重复性。

 

参考文献:Pesta D, Gnaiger E (2012) High-resolution respirometry. OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibres from small biopisies of human muscle. Methods Mol Biol 810: 25-58.

应用方法(三):

O2k光电联合同步检测线粒体耗氧率与H2O2 

关键词:脑组织、线粒体、耗氧率、H2O2、实时同步检测

 

 

 

实验中分别添加丙酮酸、谷氨酸、ADP、琥铂酸、鱼藤酮、寡霉素、FCCP、抗霉素等,实验结果显示线粒体在底物型试剂添加过程中其耗氧率随底物的添加产生变化,而活性氧的变化不明显。当抑制剂添加之后,明显可见活性氧产生积累,进而影响耗氧率的变化情况。 

 

应用方法(四):

O2k光电联合同步检测线粒体耗氧率与线粒体膜电位

关键词:脑部、组织匀浆、耗氧率、线粒体膜电位、实时同步检测

 

 

 

实验使用小鼠脑部的新鲜组织匀浆液,通过O2k的氧电极和荧光模块相结合,共同检测样本的耗氧率和线粒体膜电位( Δψmt or mtMP );如图所示,两种不同的干预条件,即Mna(红色)和carrier(绿色),小鼠脑部组织匀浆液在磷酸化过程和最大耗氧率测量中均发生了明显的差异性,同时观察到线粒体膜电位( Δψmt or mtMP )发生同步变化。

 

参考文献:Krumschnabel G, Eigentler A, Fasching M, Gnaiger E (2014) Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol 542:163-81.

 

应用案例一(肿瘤领域):

 

 

肿瘤形成与线粒体功能恢复具有相关性

关键词:肿瘤细胞、线粒体功能、复合体II

 

 

 

 

 

4T1ρ0细胞是一种mt基因缺陷型细胞,该细胞在小鼠体内因基因缺陷导致细胞功能缺失而无法形成肿瘤,其能量代谢如图所示,其与正常癌细胞 4T1(Par)效果完全不同,4T1(Par)细胞可根据添加不同试剂产生相应的能量代谢曲线变化,4T1ρ0细胞则没有任何变化;4T1ρ0细胞注入小鼠体内形成4T1ρ0SC细胞,随时间延长,可形成血液中的4T1ρ0CTC 循环肿瘤细胞、以及4T1ρ0SCL 肺转移肿瘤细胞;能量代谢测量结果可见,随肿瘤细胞在生物体内的时间增长,肿瘤微环境可诱导4T1ρ0SC mt基因缺陷型小鼠乳腺癌细胞逐步恢复线粒体功能,并且在对4T1ρ0SCL 肺转移肿瘤细胞的能量代谢测量过程中发现,线粒体功能的恢复与线粒体内膜上的复合体II(CII)的功能具有相关性;实验结合了活体动物肿瘤形成物理观察,结果发现,线粒体功能的恢复与肿瘤形成具有一定的相关性。 

 

参考文献:Tan AS, Baty JW, Dong L, Bezawork-Geleta A, Endaya B, Goodwin J, Bajzikova M, Kovarova J, Peterka M, Yan B, Pesdar EA, Sobol M, Filimonenko A, Stuart S, Vondrusova M, Kluckova K, Sachaphibulkij K, Rohlena J, Hozak P, Truksa J, Eccles D, Haupt LM, Griffiths LR, Neuzil J, Berridge MV (2015) Mitochondrial genome acquisition restores respiratory function and tumorigenic potential of cancer cells without mitochondrial DNA. Cell Metab 21:81-94.

应用案例二(精神类疾病领域)

 

 

社交障碍模型果蝇脑部线粒体活性增加

关键词:果蝇头部、果蝇身体、线粒体、复合体I、复合体II、最大电子传递能力

 

 

 

 

对健康果蝇和社交障碍模型Cyfip85.1/+果蝇的头部和身体两个部分的线粒体功能进行检测,在行为学监测中,明确Cyfip85.1/+果蝇在竞食、求偶、社交等活动中处于明显的孤立状态,但在能量代谢检测中可见, Cyfip85.1/+果蝇头部线粒体在复合体I、复合体II、最大电子传递能力以及非线粒体耗氧等方面处于明显的过度活跃状态,而身体部分的线粒体与正常的健康果蝇相比却无明显变化,表明在脑部精神类疾病中,线粒表现过度活跃与疾病的发病机理具有相关性。

 

参考文献:Kanellopoulos AK, Mariano V, Spinazzi M, Woo YJ, McLean C, Pech U, Li KW, Armstrong JD, Giangrande A, Callaerts P, Smit AB, Abrahams BS, Fiala A, Achsel T, Bagni C (2020) Aralar sequesters GABA into hyperactive mitochondria, causing social behavior deficits. Cell 180:1178-97.

应用案例三(神经领域)

 

 

小鼠PARL缺乏导致Complex III缺陷、辅酶Q耗竭和Leigh样综合征O2k 

关键词:关键词:突触体、复合体I、复合体II、复合体IV、脑部线粒体、钙离子、线粒体膜电位、ROS

 

 

 

PARL蛋白酶是菱形家族中唯一已知的线粒体蛋白酶成员。菱形蛋白酶是一种线粒体膜内切割蛋白酶和假蛋白酶,涉及多种功能。菱形蛋白酶常与人类流行疾病(包括癌症和神经退行性疾病)具有一定的病理相关性,菱形蛋白酶在维持线粒体结构和功能方面具有重要的生理作用。当 PARL 蛋白酶被消融时线粒体会严重受损,可导致神经Leigh 样变性,类似于人类线粒体疾病 Leigh 综合征。这种显著的神经变性与细胞凋亡的改变无关,而是与大量坏死有关,这引发了潜在机制性的问题。

 

Parl - / -脑线粒体中的CIII 和CoQ 缺陷。使用O2k高分辨率呼吸代谢检测系统对脑神经元线粒体进行检测。蓝色曲线表示O2浓度,红色曲线表示其耗氧率。纯化的突触体(50 µg) 装入Mir06缓冲液中。滴定洋地黄皂苷 (Digi) 以实现最佳突触体通透化。底物如下:CI(PMG,丙酮酸+苹果酸+谷氨酸),CII(Succ,琥珀酸)和CIV(ASC/TMPD,抗坏血酸+TMPD)。解耦联剂是CCCP。抑制剂如下:CI(ROT,鱼藤酮)、CIII(Aa,Antimycin a)和 CIV(KCN,氰化钾)。呼吸状态用红色虚线表示。CI LEAK,CI驱动的质子漏呼吸;CI OXPHOS,CI驱动的磷酸化呼吸;CI+II OXPHOS,由CI和II的联合激活驱动的磷酸化呼吸;CI+II ET,由CI和II组合驱动的电子转移能力;CII ET,由CII驱动的ET;CIV,CIV 驱动的呼吸;Cytc,外源性细胞色素添加c以评估线粒体外膜的完整性。在过氧化氢酶存在下使用H2O2为舱室重新充氧。

 

A.使用O2k荧光模块以及Calcium Green 5N试剂对纯化的脑线粒体进行钙保留能力测试,发现Parl-/-的钙保留量明显降低

 

C.使用O2k荧光模块及Amplex UltraRed试剂对线粒体产生的ROS进行检测,除了使用 CI 底物略有增加外,所有实验条件下的 ROS 产生都相似

 

B.使用O2k荧光模块及safranin O试剂对脑线粒体中的线粒体膜电位(即Δψ)进行检测,明显可见Parl-/-脑线粒体膜电位降低

 

结果表明:PARL缺乏是对大脑氧化应激的主要影响,但我们发现对线粒体钙代谢同样也产生了严重影响。线粒体钙是细胞死亡(包括坏死)的关键决定性因素,在许多神经退行性疾病中尤为重要,包括帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病以及由另一种线粒体蛋白酶AFG3L2突变引起的遗传性神经系统疾病。

 

参考文献:Spinazzi M, Radaelli E, Horré K, Arranz AM, Gounko NV, Agostinis P, Maia TM, Impens F, Morais VA, Lopez-Lluch G, Serneels L, Navas P, De Strooper B (2019) PARL deficiency in mouse causes Complex III defects, coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 116:277-86.

对线粒体的有氧呼吸进行测量

包括了呼吸控制比(RCR)、氧化磷酸化(OXPHOS)、呼吸储备能力(Spare Respiratory Capacity)以及质子漏水平(Proton Leak)。实验结果表明,AβOs组呼吸储备力有明显下降

应用方法四(神经领域):

 

 

鸟苷维持突触体线粒体钙稳态并对神经具有保护作用

关键词:突触体、线粒体、呼吸储备能力、ROS、ATP、钙离子

 

阿尔茨海默病 (AD) 是一种神经退行性疾病,会导致记忆力减退、认知障碍和情绪障碍。随着全球人均寿命的延长,阿尔兹海默症的患病率逐年增加,截止目前,阿尔兹海默症的发病原因仍然成迷,其致病原因可能与遗传、环境有关,随着患病率的上升,我们迫切需要开发新的预防与治疗方法。触体是神经元之间在功能上发生联系的部位,也是信息传递的关键部位。使用 淀粉样蛋白 β 寡聚体 (AβOs)的ICV注射入小鼠脑内,形成AD小鼠模型,口服GUO(鸟苷)用于评估嘌呤对神经线粒体的保护作用。

该实验使用OROBOROS O2k细胞能量代谢系统对突触体内的线粒体功能进行评估,主要涉及线粒体功能的四个方面:线粒体的有氧呼吸能力、ATP产生能力、活性氧的产生速率以及线粒体的钙离子吸收留存能力。

 

总之,由于神经突触体对线粒体的高度依赖,线粒体功能受损可能会导致神经活动紊乱,甚至细胞死亡。在这项研究中AβOs 降低线粒体的呼吸储备能力,降低 ATP 水平,损害 Ca2+吸收留存能力,且在电镜观察中可见海马突触体中的线粒体发生肿胀。鸟苷(GUO)可过血脑屏障恢复短期记忆,重建谷氨酸摄取,复线粒体 Ca2+ 稳态,并部分防止线粒体肿胀。因此,这种内源性嘌呤对神经突触体线粒体具有保护作用。

 

参考文献:Souza da Silva J, Nonose Y, Rohden F, Lukasewicz Ferreira PC, Fontella FU, Rocha A, Wigner Brochier A, Vieira Apel R, de Lima TM, Seminotti B, Amaral AU, Galina A, Souza DO (2020) Guanosine neuroprotection of presynaptic mitochondrial calcium homeostasis in a mouse study with amyloid-β oligomers. Mol Neurobiol 57:4790-809.

 

对突触体线粒体内的ATP产生力进行测量

AβOs组的ATP水平明显降低,在加入ADP之后,其ATP合酶开始工作,可见服用GUO的小鼠突触体的ATP产生能力明显高于对照组,GUO的小鼠突触体在ATP直接测量上具有明显作用

对突触体线粒体内的ATP产生力进行测量

 

可见AβOs组的活性氧产生明显高于对照组,样本对于AβOs产生了明显的氧化应激反应,在整个呼吸过程中,AβOs产生的氧化应激一直存在,且随着不同底物的添加其活性氧产生的程度也有差异

 

对突触体内线粒体钙离子的吸收留存能力进行测量

AβOs降低了样本线粒体的钙离子吸收留存能力,而GUO的摄入,可降低AβOs造成的钙离子丧失,说明GUO对线粒体具有一定的保护力

 

应用方法五(心血管领域):

 

小鼠亚精胺喂养增强心脏线粒体呼吸能力

关键词:关键词:心肌、线粒体、亚精胺、氧化磷酸化能力

 

 

 

Spermidine是一种天然类药物,实验表明Spermidine可改善小鼠的心肌细胞组成以及线粒体功能。在C57BL/6雄性小鼠的生命后期添加喂食药物 Spermidine(+S),并对24月龄小鼠的心肌纯化线粒体进行能量代谢分析。实验过程中可见,当滴加试剂ADP用于启动ATP合酶功能,将TCA产生的电子传递与磷酸化过程进行耦联,服用Spermidine(+S)的小鼠心肌纯化线粒体的功能较对照组小鼠有明显的上升,数据统计可见Spermidine(+S)药物可改善线粒体中的ATP合酶的功能,进而提高线粒体的氧化磷酸化能力。

 

参考文献:Eisenberg T, Abdellatif M, Schroeder S, Primessnig U, Stekovic S, Pendl T, Harger A, Schipke J, Zimmermann A, Schmidt A, Tong M, Ruckenstuhl C, Dammbrueck C, Gross AS, Herbst V, Magnes C, Trausinger G, Narath S, Meinitzer A, Hu Z, Kirsch A, Eller K, CarmonaGutierrez D, Büttner S, Pietrocola F, Knittelfelder O, Schrepfer E, Rockenfeller P, Simonini C, Rahn A, Horsch M, Moreth K, Beckers J, Fuchs H, Gailus-Durner V, Neff F, Janik D, Rathkolb B, Rozman J, de Angelis MH, Moustafa T, Haemmerle G, Mayr M, Willeit P, von Frieling-Salewsky M, Pieske B, Scorrano L, Pieber T, Pechlaner R, Willeit J, Sigrist SJ, Linke WA, Mühlfeld C, Sadoshima J, Dengjel J, Kiechl S, Kroemer G, Sedej S, Madeo F. (2016). Cardioprotection and lifespan extension by the natural polyamine spermidine. Nat Med. 22(12):1428-1438.

应用方法六(高原科学领域):

 

 

高海拔低氧适应的代谢基础

关键词:高海拔、低氧、骨骼肌、活检肌肉组织、线粒体功能

 

 

 

尼泊尔夏尔巴人在ATP(三磷酸腺苷)的生产中表现出更高产出效率,即使他们在较低的海拔中开展工作,也能保持这种高效的能量产出效率。在夏尔巴人的骨骼肌活检中,在海拔1400米和5300米分别测量了组织纤维的呼吸作用,发现线粒体中基础代谢差异不大(A)、复合体II(琥铂酸S的作用,B)和TCA重构(GMS加入开启TCA,C)过程中,夏尔巴人具有明显的耗氧率低,脂肪酸的氧化分解能力较低(D),因此夏尔巴人可以更有效地利用氧气,改善肌肉的能量并防止氧化应激。高海拔低氧适应性能够更有效的支持肌肉运动。                                                                   

Baseline:海拔1400米活检人肌肉组织

Altitude1: 海拔5300米短期适应活检肌肉组织                                              

Altitude2: 海拔5300米长期适应活检肌肉组织。

 

参考文献:Souza da Silva J, Nonose Y, Rohden F, Lukasewicz Ferreira PC, Fontella FU, Rocha A, Wigner Brochier A, Vieira Apel R, de Lima TM, Seminotti B, Amaral AU, Galina A, Souza DO (2020) Guanosine neuroprotection of presynaptic mitochondrial calcium homeostasis in a mouse study with amyloid-β oligomers. Mol Neurobiol 57:4790-809.

 

应用方法七(骨骼肌领域):

 

 

线粒体MDM2独立于p53调节复合体I的活性

 

关键词:骨骼肌匀浆液、线粒体功能、复合体I

 

 

 

MDM2是一种癌基因,MDM2的表达水平增强会提高癌细胞的迁移和侵袭特性,同时MDM2癌基因表达导致线粒体功能降低也有助于其致癌特性的提高;本实验中敲除MDM2基因(sh MDM2)后,可见线粒体功能有明显提高,并且主要实行功能的蛋白为线粒体内膜上的复合体I(CI),其他复合蛋白(CII、CIV)与正常细胞无明显差异;MDM2的另外两种处理方法分别为FL-MDM2(FLAG-tagged full-length (aa 1–491) MDM2)以及MTS-MDM2(mitochondrial targeting sequence MDM2),这两种MDM2处理方法对样本线粒体功能的影响同样集中于复合体I(CI),能量代谢检测中可见复合体I(CI)的功能明显弱于对照组(Empty),其他复合蛋白无明显差异; 对小鼠骨骼肌匀浆液的能量代谢检测实验结果表明,骨骼肌中MDM2基因缺失会提高线粒体能力,降低致癌风险,增加复合体I(CI)活性和肌肉产能能力。

 

参考文献:Arena G, Cissé MY, Pyrdziak S, Chatre L, Riscal R, Fuentes M, Arnold JJ, Kastner M, Gayte L, Bertrand-Gaday C, Nay K, Angebault-Prouteau C, Murray K, Chabi B, Koechlin-Ramonatxo C, Orsetti B, Vincent C, Casas F, Marine JC, Etienne-Manneville S, Bernex F, Lombès A, Cameron CE, Dubouchaud H, Ricchetti M, Linares LK, Le Cam L (2018) Mitochondrial MDM2 regulates respiratory complex I activity independently of p53. Mol Cell 69:594-609.

 

应用方法八(骨骼肌领域):

 

 

删除miR-1/133a会损害线粒体功能

关键词:小鼠骨骼肌纯化线粒体、小鼠骨骼肌纤维

 

在分化的心肌细胞中,miR-1 / 133a基因表达会下调Mef2A,从而抑制了印记域Dlk1-Dio3的表达,该印记域能够编码多个抑制线粒体基因的蛋白。骨骼肌中miR-1 / 133a基因的缺失或者Mef2A的增加同样会导致印记域Dlk1-Dio3基因的表达连续增高,进而出现明显的线粒体功能障碍。实验结果表明,在小鼠骨骼肌线粒体(MSMM)的能量代谢测量中,发现dKO组和Mef2A组的复合蛋白物II的耗氧率要明显低于control组,说明miR-1/133a的敲除和Mef2A的含量增加对线粒体的功能损伤与复合蛋白物I的功能具有明显相关性;在小鼠肌纤维(EDL fibers)的测量中,dKO组的复合蛋白物I与control组相比出现了明显的降低, Mef2A组复合蛋白物I和复合蛋白物II的耗氧能力与control组相比都出现了明显降低,因此miR-1/133a的敲除和Mef2A的含量增加对线粒体的功能具有明显的损伤。

 

 

参考文献:Wüst S, Dröse S, Heidler J, Wittig I, Klockner I, Franko A, Bonke E, Günther S, Gärtner U, Boettger T, Braun T (2018) Metabolic maturation during muscle stem cell differentiation is achieved by miR-1/133a-mediated inhibition of the Dlk1-Dio3 mega gene cluster. Cell Metab 27:1026-39

 

应用方法九(植物领域):

 

 

植物激素信号传导调控线粒体蛋白质稳态

关键词:暗呼吸检测;样本:拟南芥-叶片、线粒体

 

方法:

使用Oroboros O2k在24℃黑暗中测量叶片暗呼吸。

首先将来自拟南芥植物的叶盘悬浮在叶片呼吸缓冲液中,在黑暗中孵育30分钟,然后记录耗氧率。根据叶盘的鲜重归一化计算耗氧率。

使用Oroboros O2k在24℃在黑暗中对拟南芥植物叶片中分离的线粒体进行暗呼吸测定。在测量过程中,将线粒体蛋白悬浮在反应混合物中分别加入丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、ADP和没食子酸正丙酯测量复合物I呼吸能力,然后加入琥珀酸盐测量总呼吸能力。

结果:

(A) mrpl1-1, mrpl1-3 (mitochondrial ribosomal protein L1, MRPL1) 是拟南介线粒体核糖体蛋白 L1突变体,与野生型相比,突变体叶片整体OCR显著降低;

(B) Dox是一种抑制线粒体蛋白翻译的强力霉素,野生型经Dox处理后,其线粒体整体OCR显著降低,复合物I呼吸能力也显著降低;

(C) ACC(乙烯前体)是由ACC合酶合成的非蛋白氨基酸,ACC经常被用来诱导乙烯响应,而乙烯抑制根的生长;Ag2+是乙烯抑制剂,分别用ACC和Ag2+处理野生型,只有通过ACC处理后的线粒体整体OCR显著升高,复合物I呼吸能力也显著升高。

结论:

拟南芥MRPL1 功能突变体实验(实验A)和Dox药物处理实验(实验B)引起线粒体翻译受损,降低复合物I呼吸能力和整体呼吸能力,乙烯能够通过其信号传导调控线粒体蛋白质稳态,提高复合物I呼吸能力和整体呼吸能力。

 

 

参考文献:Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress. 2017 Nov 2;68(3):540-551.e5.

应用方法十(植物领域):

 

 

鸟苷维持突触体线粒体钙稳态并对神经具有保护作用

关键词:呼吸作用;样本:烟草叶、线粒体

 

方法:

使用Oroboros O2k对WT和P07(转基因AtUCP1高表达)植物的粗分离线粒体进行线粒体呼吸的测量。首先进行粗分离线粒体,然后将含有粗线粒体的沉淀重悬于洗涤缓冲液中。苹果酸和谷氨酸被用作呼吸的底物。添加ADP以测量ADP依赖性呼吸。寡霉素用作ATP合酶抑制剂来测量由于解偶联活性引起的耗氧量,化学离子载体羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP)(2μM) 用于测定最大耗氧量。

结果:

WT和P07植物烟草叶中分离的粗线粒体保留了它们的呼吸特性:与基础呼吸相比,ADP和FCCP可以有效地增加耗氧量。

结论:

AtUCP1过表达增加解偶联呼吸能力

 

参考文献:BMC Plant Biology | Systems Overexpression of UCP1 in tobacco induces mitochondrial biogenesis and amplifies a broad stress response