奥地利OROBOROS  O2k药物能量代谢解决方案

 

线粒体是细胞生命活动的能量工厂,是几乎所有真核生物。都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP,是糖类、脂肪和氨基酸等物质的最终氧化释放能量的场所,对维持生物体正常生理功能至关重要;线粒体除了作为细胞内能量生成的关键细胞器,还参与细胞凋亡、自由基生产、脂质代谢等代谢过程,其功能障碍与癌症、糖尿病、高血压、肌肉减少症、肌肉萎缩症、心力衰竭、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症、帕金森症、慢性肾病、巴氏综合症、亨廷顿舞蹈症等多种疾病的发生发展密切相关。因此,线粒体是这些疾病的一个重要药物靶点,一些旨在治疗性恢复线粒体功能的策略正在出现,少数药物已进入临床试验。

APPLICATION FOR MEDICINE ENERGY

METABOLISM

案例一:药物开发线粒体毒性评估前线粒体质量分析

 

关键词:线粒体、RCR

 

 

引言:线粒体是药物毒性作用的重要靶标。在新药研发过程中,线粒体毒性已经成为多种药物研发失败或临床应用受限的重要因素,一些国际大型制药公司和管理机构纷纷将线粒体毒性评价作为候选药物临床前安全性评价的重要内容。针对药物致靶器官线粒体损伤的特点及可能机制,结合21世纪毒性测试策略,分别从体内和体外试验建立药物致线粒体毒性的评价方法,重点从线粒体氧化应激和线粒体生成角度探讨了药物致靶器官线粒体毒性的可能作用机制。其中用于线粒体毒性的评价方法的线粒体样品的质量评价标准是大家没有关注到的,尤其是对不同批次不同冻存方法分离的线粒体的结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率的一致性评价,现在还缺乏快速有效的评价方法。

 

 

摘要:在这篇文献中作者为了以快速有效的方式筛选新的线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)抑制剂,开发并改进了一种使用冷冻保存剂海藻糖对分离的线粒体进行冻融并保持线粒体活性功能的方法,然后用O2k测量线粒体耗氧量变化,通过分析线粒体在ADP存在(III态呼吸)与否(IV态呼吸)的情况下溶解氧的消耗差异,即呼吸控制率(RCR),从而评估线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率在不同冻存时间的一致性。

 

结果:如图所示,使用冷冻保存剂海藻糖对分离的线粒体进行冻融并保持线粒体活性功能没有显著性差异,一致性非常好。

 

参考文献:Briston T, etc. Identification of ER-000444793, a Cyclophilin D-independent inhibitor of mitochondrial permeability transition, using a high-throughput screen in cryopreserved mitochondria. Sci Rep. 2016 Nov 25;6:37798. doi: 10.1038/srep37798.

案例二:抗癌治疗化学创新药物研发

 

关键词:化药、复合体I、ROS

 

 

引言:据《2018年全国最新癌症报告》显示,恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁中国人群的主要健康问题之一,根据最新的统计数据显示,恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91%,且近十几年来恶性肿瘤的发病率死亡率均呈持续上升态势,每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿,防控形势严峻。靶向药物由于其毒副作用小、特异性高等优势,对于治疗肿瘤有显著疗效,已经成为近几年抗肿瘤新药的主流。据统计,在1997-2017年期间,FDA(美国食品和药物管理局)共批准141个抗肿瘤药物上市(不含辅助药物),其中化学药物106个,化学药物中包括50个常规化疗药物,以及56个分子靶向药物(占抗肿瘤化学药的52.8%)。

 

摘要:本研究旨在研究由融合异硒唑鎓盐(fused isoselenazolium salts)引起的乳腺癌细胞生长抑制的机制。其中线粒体功能实验表明,融合异硒唑鎓盐可抑制丙酮酸依赖性呼吸,丙酮酸是体内产生的三碳酮酸,它是糖酵解途径的最终产物,在细胞浆中还原成乳酸供能,或进入线粒体内氧化生成乙酰CoA,进入三羧酸循环,被氧化成二氧化碳和水,完成葡萄糖的有氧氧化供能过程,所以丙酮酸是糖代谢中具有关键作用的中间产物;另外融合异硒唑鎓盐不直接影响电子转移系统的复合体 I。此外,测试的化合物会立即显著增加活性氧的产生。异硒唑鎓盐可能是非常有希望的开发用于抗癌治疗的有效候选药物的平台。

 

结果:三种测试的异硒唑鎓衍生物(3、6和7)都会立即显著增加 H2O2的产生。化合物6对 H2O2产生和H2O2/O比率的影响最为显着(分别增加2.3倍和2.8倍)。此外,在用6处理的细胞中观察到H2O2产生和CI&II连接的OXPHOS状态下H2O2/O比率的显着增加。乳腺癌细胞增殖严重依赖丙酮酸代谢。异硒唑鎓盐在不影响复合体I的情况下阻断丙酮酸依赖性线粒体呼吸,导致癌细胞代谢的选择性破坏并显著增加ROS的产生。因此,异硒唑鎓盐表现出双重活性:它们既能抑制依赖丙酮酸的代谢,又能同时诱导导致癌细胞分裂抑制和癌细胞毒性作用的氧化应激。

 

 

参考文献:Makrecka-Kuka, et al. “Fused isoselenazolium salts suppress breast cancer cell growth by dramatic increase in pyruvate-dependent mitochondrial ROS production.” Scientific reports vol. 10,1 21595. 9 Dec. 2020, doi:10.1038/s41598-020-78620-8.

案例三:抗肿瘤化疗药物DLCs研发

 

关键词:复合体I、ROS、光动态疗法

 

 

引言:在过去的十年里,癌症的治疗取得较大的进展,尤其是一些较好的靶向药的出现,使癌症的致死率连续降低。在癌症的治疗中通常将线粒体作为药物作用靶点。线粒体的膜电位在肿瘤细胞中比在正常细胞中低,所以离域亲脂阳离子(DLC)可以用作肿瘤的靶向基团。同时由于线粒体对热休克很敏感,同时线粒体具有产生活性氧(ROS)的富氧细胞环境,是最适合光动力疗法(PDT)触发细胞凋亡的细胞器。

 

摘要:D112 就是这样一种具有前景的 DLC。在这里,作者显示D112优先进入转化细胞,在那里它与线粒体 DNA相互作用并破坏线粒体 DNA,抑制复合体 I 呼吸并诱导活性氧 (ROS)。重要的是,D112的光激活增强了选择性 ROS 的产生,光动力疗法将是 D112 研究的一个令人兴奋的辅助手段,并且可能普遍适用于目前正在接受治疗研究的其他 DLC。

 

结果:为了检查D112是否通过抑制电子流诱导ROS产生,作者使用O2k来测量细胞中的线粒体耗氧量。与增加量的D112一起孵育导致常规呼吸减少(图d),表明D112抑制完整细胞中的线粒体呼吸。为了测试D112是否阻止电子流,通过增加解偶联剂FCCP的浓度来消散内膜的质子动力,以诱导最大电子流(ETS 容量)。作者发现D112以剂量依赖性方式降低ETS容量。有趣的是0.0625μg/ml D112显着降低电子流而不增加泄漏呼吸,表明D112的主要作用是抑制电子传递而不是引起线粒体膜损伤(图d)。为了定位ETS中的缺陷,作者测试了渗透细胞中的线粒体呼吸,发现 0.0625μg/ml D112处理的细胞的常规呼吸减少,而LEAK呼吸不受影响(图e和f),证实了在没有线粒体膜损伤的情况下电子传递抑制。在苹果酸和丙酮酸(图e和f)和ADP存在下测量的复合体 I 呼吸被D112显着阻断,这表明复合体I存在缺陷。相比之下,复合体II和IV呼吸不受影响(图e和f)。总之,这些研究表明D112抑制了来自ETS复合体I的电子流,从而确定了D112介导的ROS产生的机制。同时作者检查了光激活是否增加了D112的功效。为了模拟 PDT (photodynamic therapy,光动态疗法)应用,将细胞暴露于541 nm激光的单脉冲(0、10、30 或 60 秒),3 小时后记录细胞形态,结果显示光激活增强了癌细胞的选择性杀伤。光激活放大了D112介导ROS 的产生。

 

参考文献:Yang, N. et al. Photo-activation of the delocalized lipophilic cation D112 potentiates cancer selective ROS production and apoptosis. Cell Death Dis8, e2587 (2017). https://doi.org/10.1038/cddis.2017.19

案例四:转录因子靶向抑制剂药物研发

 

关键词:T细胞、转录因子抑制剂

 

 

引言:传统的药物靶点绝大部分是具有适合的结合位点和明确的活性位点的蛋白质。药物分子往往通过“占位驱动”的药理学作用模式发挥作用。这种方法虽然可行,但并不能适用于所有的靶蛋白,尤其是在蛋白本身缺乏相应的结合口袋、蛋白的内源性底物高亲和力、蛋白存在于细胞内部药物分子无法抵达、蛋白的致病机制不依靠蛋白间相互作用或催化活性等情况。随着对癌症进展的分子基础和多种驱动因素的深入理解,科学家开始寻找能够高效抑制生长因子受体、酶类或其他靶点的药物。转录因子(Transcription factors,TFs)是一类与基因特定序列专一性结合,从而控制目的基因以特定强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。作为基因表达调控的重要组成部分,TFs广泛参与体内生理与病理过程。据估计,人类基因组中至少有1600个转录因子,其中约19%与多种疾病密切相关,包括癌症、自身免疫病、糖尿病、心血管疾病等。鉴于TFs对靶基因的直接调控作用,它们相比激酶、GPCR等上游信号蛋白具有更高特异性的疾病调节能力,并可避免信号通路串扰带来的副作用。转录失调与多种疾病的发生发展密切相关,TFs作为驱动转录程序的关键部分,极具靶向治疗意义。

 

摘要:HIV-1(人类免疫缺陷病毒I型)依赖宿主细胞提供代谢资源以完成其病毒复制周期。因此,HIV-1 仅在活化的 CD4+ T 细胞中有效复制。因为 FOXO1 是 T 细胞功能的主要调节因子,作者研究了其抑制对 T 细胞/HIV-1 相互作用的影响。通过使用 FOXO1 药物抑制剂 AS1842856,作者观察到 FOXO1 抑制在没有任何刺激信号的情况下诱导 T 细胞的代谢激活。AS1842856 对 FOXO1 的抑制使静息 T 细胞允许 HIV-1 感染。作者得出结论,FOXO1 在 HIV-1/T 细胞相互作用中具有核心作用,并且用 AS1842856 等药物抑制 FOXO1 可能是一种新的治疗性休克和杀伤策略,以消除人类 T 细胞中的 HIV-1 储存库。

结果:使用 O2k 仪器测量用 AS1842856处理7天或仅载体处理的活T细胞的高分辨率呼吸测量。首先测量常规呼吸(呼吸稳态),然后添加寡霉素以抑制ATP合酶,将呼吸降低到基线泄漏状态。然后使用连续的CCCP(羰基氰化物间氯苯肼)滴定将呼吸刺激到电子转移能力的非耦合状态(给出最大呼吸能力)。 右侧结果显示来自5个独立实验T细胞的常规呼吸和最大呼吸能力的平均结果。

 

参考文献:Roux, Arthur et al. “FOXO1 transcription factor plays a key role in T cell-HIV-1 interaction.” PLoS pathogens vol. 15,5 e1007669. 1 May. 2019, doi:10.1371/journal.ppat.1007669.

案例五:天然产物药物抗癌研究

 

关键词:复合体IV

 

 

引言:据世界卫生组织资料统计,全球每年癌症发病约1000万,死亡约700万,已成为仅次于心血管病的人类第二杀手。而近几年中国每年新增肿瘤病人200万人,死亡130多万人,目前全国肿瘤患者总数约为450万人左右。化学合成的抗肿瘤药物在临床上虽然占据主要地位,但是随着人们越来越深刻地认识到它的毒副作用,从天然药物中寻找抗癌有效成分,已成为越来越多的药物相关工作者关注的重点。根据有关媒体报道,美国早在20世纪50年代开始就开始从天然植物中寻找抗肿瘤药物,美国国立癌症研究所(NCI)平均每年要评估1500-5000种植物,其筛选的化合物更是高达上万种。而随着近几年研究的深入,在新的抗肿瘤药物、植物提取成份和化合物合成方面都有重大的突破,目前已上市的天然抗肿瘤药物有包括紫杉醇在内的13个药物,而处于临床及临床前的药物则远多于此数量。

 

 

摘要:Isoplumbagin (5-hydroxy-3-methyl-1,4-naphthoquinone),一种天然存在的醌,具有抗炎和抗菌活性。长期以来,炎症一直与癌症进展相关。在这项研究中,作者检查了Isoplumbagin的抗癌作用。作者的研究结果表明,Isoplumbagin抑制了口腔鳞状细胞癌 (OSCC) OC3-IV2 细胞、胶质母细胞瘤 U87 细胞、非小细胞肺癌 H1299 细胞、前列腺癌 PC3 细胞和宫颈癌 HeLa 细胞的细胞活力。体内研究表明 2 mg/kg Isoplumbagin对源自 OSCC 细胞的原位异种移植肿瘤(口腔颊)的生长有抑制作用。从机制上讲,Isoplumbagin通过降低癌细胞线粒体复合体 IV 活性,促进癌细胞发生凋亡,从而发挥其细胞毒性作用,起到抗癌的治疗效果。

 

结果:作者直接通过奥地利Oroboros O2k进行检测研究了Isoplumbagin如何减少癌细胞线粒体 OXPHOS。Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比,以谷氨酸/苹果酸为底物的复合体 I 功能活性和以琥珀酸为底物的复合体II 功能活性没有变化,但以四甲基对苯二胺 (TMPD)/抗坏血酸为底物的癌细胞复合体 IV的功能活性明显降低。综上所述,这些数据表明Isoplumbagin可通过抑制癌细胞线粒体复合体 IV 活性减少OXPHOS水平。值得注意的是,作者也尝试用另外一组药物处理方案,如图所示,分别添加Oligomycin、FCCP、Rotenone & Antimycin,做胞外呼吸能力测试,Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比,整体胞外呼吸能力有降低,但无法对癌细胞复合体IV功能活性是否存在显著性差异进行表征分析,无法进行更深入的机制研究。

 

 

参考文献:Tsao YC, Chang YJ, Wang CH, Chen L. Discovery of Isoplumbagin as a Novel NQO1 Substrate and Anti-Cancer Quinone. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4378. Published 2020 Jun 19. doi:10.3390/ijms21124378.

案例六:老药新用研究

 

关键词:ROS

 

 

引言:老药新用指的是将已经获批上市或处于临床研究的药物用于治疗新的疾病。传统的新药发现的流程大致为:靶点的发现、筛选先导化合物并进行结构优化、候选化合物进行细胞和动物实验、以及临床前和临床I、II、III期研究后上市,此过程耗时长、成本高,一般需要10-15年,且需要10-20亿美元。而老药新用一般是利用前期研究的药物,因此安全性、有效性以及给药方式基本都比较清晰明了,因此老药新用不仅能够降低成本、节约时间、还能提高研发的成功率。另外在药物发现史上,许多老药新用大都是临床医生偶然发现的,例如解酒药双唑仑用来抗癌、降糖药二甲双胍用来抗衰老和抗癌、毒药砒霜用来抗癌、沙利度胺用于治疗多发性骨髓瘤等等。

 

 

摘要:作者证明自1696年以来合成并用作药物的OP2113(5-(4-Methoxyphenyl)-3H-1,2-dithiole-3-thione,CAS 532-11-6)通过在线粒体呼吸链复合体I的IQ位点充当ROS产生的特异性抑制剂,意外地降低了线粒体活性氧(ROS/H2O2)的产生。对离体大鼠心脏线粒体进行的研究还表明,OP2113不影响由复合体I或复合体II底物驱动的氧化磷酸化。作者评估了OP2113对离体大鼠心脏梗塞模型的影响,其中线粒体ROS产生高度参与,并表明OP2113保护心脏组织以及心脏收缩活动的恢复。OP2113可能是新一类线粒体ROS阻滞剂 (S1QEL) 的成员,并且可以在发生ROS诱导的线粒体功能障碍的许多疾病如衰老、帕金森病和阿尔兹海默症、心房颤动和缺血再灌注损伤中保护线粒体功能。

 

结果:OP2113对线粒体氧化磷酸化没有影响:A图说明了经典的O2k检测曲线,并显示了在对照处理(蓝线)和OP2113处理(红线)存在下短暂孵育后大鼠心脏线粒体的O2浓度(实线)和O2消耗斜率(虚线)。添加呼吸底物(本试验中的谷氨酸+苹果酸),触发耗氧量的开始(底物状态,蓝色背景),然后通过添加ADP 促进磷酸化,以获得最大的氧化磷酸化率(状态3 , 红色背景)。最后,加入抑制 ADP/ATP 转运蛋白的苍术甙 (ATR),以在非磷酸化条件下(状态4)产生线粒体泄漏率(绿色背景)。OP2113保护心脏组织:在缺血30分钟和再灌注120分钟之前,用OP2113预处理心脏(OP2113)或不预处理(对照),再用TTC染色后对照组和OP2113组的典型图片,红色显示的组织是用 TTC 染色的活组织,而受损组织则显示为白色。

 

参考文献:Detaille, Dominique et al. “An old medicine as a new drug to prevent mitochondrial complex I from producing oxygen radicals.” PloS one vol. 14,5 e0216385. 2 May. 2019, doi:10.1371/journal.pone.0216385

案例七:临床治疗药物新适应症研究

 

关键词:线粒体、复合体I、复合体II

 

 

引言:一个新药的发现必然经历非药、类药、成药的转化历程,需要承担高额的投入和未知的风险,据统计,研发新药并成功上市需耗时10-15年,平均花费10-20亿美元,随着对药物安全性及有效性的要求不断提高,开发新药的成本还将持续上涨,根据Eroom定律,每隔9年新药研发成本就会大幅上升。鉴于近年来新药临床研究的高失败率,寻找现有药物的新适应症成为极具吸引力及优化药企成本/效益的新策略。所以在一款药物上市后,药物研发人员仍会锲而不舍地扩大药物的临床使用范围,增加新的适应症,以期最大限度地发挥药物的作用。适应症直接决定药物将来的市场,适应症研究的重要性不言而喻。

 

摘要:非酒精性脂肪性肝炎 (NASH) 正在成为肝细胞癌 (HCC) 的主要原因之一。尽管有严重的不良反应,但索拉非尼(Sorafenib)是晚期 HCC 的唯一一线治疗药物。在文献中,作者提到使用索拉非尼相当于HCC 临床大约十分之一剂量时,能够有效地治疗并阻止了小鼠和猴子的 NASH 进展,而没有观察到任何明显的不良事件。从机制上讲,索拉非尼在 NASH 中的益处与其在 HCC 中的经典激酶靶标无关,但涉及诱导温和的线粒体解偶联和随后激活 AMP 激活的蛋白激酶 (AMPK)。总的来说,作者研究结果证明了在 NASH 中低剂量索拉非尼治疗的先前未被认可的治疗效果和信号传导机制。作者设想这种针对 NASH 的新治疗策略有可能转化为一种有益的抗 NASH 疗法,其不良事件比目前在 HCC 中使用的药物所观察到的更少。

 

结果:为了确定索拉非尼增加 AMP/ATP 比率的机制,作者用O2k评估了电子传递链复合体对透化的原代小鼠肝细胞的呼吸能力。有趣的是,与 DMSO 相比,索拉非尼在没有 ADP 的情况下显著提高了复合体 I的功能活性。相比之下,由 ADP 为底物和由解偶联剂FCCP诱导的最大呼吸能力在索拉非尼处理的样品和对照样品之间具有可比性。因此,ATP产出降低是由于诱导线粒体解偶联而不是直接抑制复合体 I功能活性导致的。与这一概念一致,当评估复合体 II 或 IV 功能活性时,与 DMSO 处理的对照相比,索拉非尼处理的细胞表现出更高的呼吸能力和更低的 ATP 产出。索拉非尼也增加了脂肪酸诱导的呼吸作用,特别是脂肪酸诱导的非偶联呼吸作用不能被 ATP 合酶(复合体 V)抑制剂寡霉素抑制。

 

参考文献:Jian C, et al. Low-Dose Sorafenib Acts as a Mitochondrial Uncoupler and Ameliorates Nonalcoholic Steatohepatitis. Cell Metab. 2020 May 5;31(5):892-908.e11. doi: 10.1016/j.cmet.2020.04.011.

案例八:一线肿瘤治疗药物耐药性研究

 

关键词:线粒体、复合体I、复合体II

 

 

引言:肿瘤耐药性是限制目前癌症化疗药物疗效的一大难题。很多癌症患者在化疗初期疗效显著,但是随着治疗时间延长,癌细胞的耐药性增强,最终导致治疗失败。同时最近的研究显示癌细胞对免疫治疗药物也会存在耐药性。那么癌细胞为什么会产生耐药性?这一问题仍然存在很多挑战。肿瘤耐药包含一系列机制,大致可以分为药物相关的耐药机制以及细胞应答相关的耐药机制两种。药物相关的耐药机制包括药物摄取、药物代谢及药物靶点改变等。此外,细胞通过DNA损伤修复、激活存活相关信号通路、降低凋亡率、改变肿瘤微环境等方式抵抗药物毒性。代谢重编程是肿瘤的重要特征之一,越来越多的证据表明,癌细胞利用代谢重编程来在致癌信号阻断的情况下存活。伴随着肿瘤代谢重编程,细胞内外的一些代谢产物对基因表达、细胞分化和肿瘤微环境均具有深远的影响。其中最显著的变化包括糖酵解的激活、脂质代谢的增加、线粒体生物合成增强以及磷酸戊糖通路的激活。所以从能量代谢的角度对肿瘤耐药机制的研究将有利于发现针对性的可能治疗策略,这不仅有助于在耐药发生后补救治疗,也能提前阻止耐药的发生。

 

摘要:舒尼替尼(sunitinib)是一种血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂,是晚期透明细胞肾细胞癌(RCC)的标准一线治疗药物,但耐药性不可避免。活性氧的产生与对化疗的敏感性有关,但其潜在机制尚不完全清楚。在这里,作者使用 RCC 细胞系 ACHN 和 786-O 研究了导致耐药的机制。文献中提到,耐药细胞表现出细胞凋亡减少、细胞活力增加、活性氧产生增加和线粒体功能中断。此外,长期舒尼替尼用药治疗导致 Sirt5/异柠檬酸脱氢酶 2 (IDH2) 表达水平的上调。敲除 Sirt5/IDH2 会损害线粒体功能并部分减弱耐药性。总之,Sirt5/IDH2 的失调通过影响抗氧化能力部分地促成了肾细胞癌细胞对舒尼替尼的耐药性。

 

 

结果:作者通过O2k分析了线粒体代谢状态,以更好地说明耐舒尼替尼细胞系(Sun-R)的耐药机制。 O2k结果表明,相对于Cont对照组细胞,Sun-R 细胞具有增加的复合体 I 依赖性氧化磷酸化 (CI OXPHOS)、最大氧化磷酸化 (CI+II OXPHOS) 和非耦合状态复合体 I+II 支持的非耦合呼吸 (CI+II ETS) 值。另外作者通过O2k也分析了sirt5 敲低对线粒体呼吸功能的影响。与 siNC 相比,siSirt5 显著降低了RCC 细胞系 ACHN 和 786-O中的复合体 I OXPHOS、复合体 I+II OXPHOS 和复合体 I+II ETS。

 

参考文献:Meng L, et al. Dysregulation of the Sirt5/IDH2 axis contributes to sunitinib resistance in human renal cancer cells. FEBS Open Bio. 2021 Mar;11(3):921-931. doi: 10.1002/2211-5463.13090.

案例九:抗耐药性候选药物研究

 

关键词:ROS

 

 

引言:生存的进化压力推动了耐药性的出现,从而对现代医学提出了重大挑战。用于临床的抗肿瘤药物普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题,因此继续寻找选择性高、毒副作用小的抗癌候选药是抗肿瘤新药研究的重点。大量研究表明,恶性肿瘤中细胞凋亡过程严重紊乱,其细胞凋亡抑制作用在肿瘤的发生发展过程中具有关键地位。因此,诱导肿瘤细胞凋亡在恶性肿瘤的临床治疗过程中具有重要意义。肿瘤细胞中,产生凋亡诱导因子ROS的氧化磷酸化途径抑制、凋亡抑制基因Bcl-2表达上调,通过抑制Caspase介导的细胞凋亡途径抑制细胞凋亡、死亡受体(Fas)介导的细胞凋亡途径紊乱、细胞凋亡相关基因p53、c-Myc等基因突变以及热休克蛋白(HSP)的表达异常等均会导致肿瘤细胞产生凋亡抑制。而肿瘤细胞能量代谢的重要组成部分线粒体是多种促凋亡信号分子的作用靶点,因此,从能量代谢的角度制定新的策略来避免肿瘤耐药性,可能成为抗耐药性候选药物研究的一个新的方向。

 

 

摘要:用于治疗疟疾的青蒿素 (ART) 的发现获得了 2015 年诺贝尔医学奖,这启发了 ART 用于治疗包括癌症在内的其他疾病的重新发现和发展。在这项研究中,作者研究了 ART 和双氢青蒿素 (DHA) 对多发性骨髓瘤 (MM) 细胞(包括原代 MM 细胞)和 5TMM3VT 小鼠模型的潜在治疗效果。体外和体内实验均表明,与 ART 相比,DHA 可能是一种更有前途的抗 MM 剂,其疗效显著提高。机理分析表明,DHA 通过与亚铁 (Fe2+) 离子和氧相互作用产生活性氧 (ROS) 来激活线粒体凋亡途径,作者进一步证明 DHA 治疗可以克服 Dexa 耐药性并增强 MM 中的 Dexa 治疗效果。总之,作者研究表明,DHA 在 MM 治疗中优于 ART,并在体外和体内克服了 Dexa 耐药性,为 MM 治疗提供了有希望的治疗策略。

 

结果:通过O2k确定 ART 和 DHA 是否改变线粒体 OCR,用 ART 或 DHA 处理MM 细胞 48 小时,将寡霉素 A 添加到细胞中以检查与 ATP 合成相关的耗氧量,添加解偶联剂FCCP以确定最大呼吸能力,使用抗霉素A和鱼藤酮测定备用呼吸量。如图所示,仅用 DHA 处理会导致 OCR 显着增加,这表明 DHA主要通过增加线粒体 OCR 来增加 ROS 的浓度。作者为了在体内复制了其研究结果,使用 MM 异种移植小鼠模型来评估 DHA 与 Dexa 组合的抗肿瘤活性。 NOD-SCID小鼠皮下注射MM.1S或MM.1R细胞;与未经治疗的小鼠相比,经 Dexa 或 DHA 治疗的小鼠的肿瘤生长较慢,与单独的任一治疗相比,联合治疗导致肿瘤生长显著降低。

 

参考文献:Chen Y, et al. Dihydroartemisinin Induces Growth Arrest and Overcomes Dexamethasone Resistance in Multiple Myeloma. Front Oncol. 2020 May 15;10:767. doi: 10.3389/fonc.2020.00767.

案例十:用于替代/补充治疗的药物研究

  

关键词:细胞耗氧量

 

 

引言:引言:肿瘤的发病机制复杂。为克服耐药,实现更早期、更深度的疾病缓解,延长疾病缓解时间和患者生存时间,积极探索不同形式的替代或补充用药方案,是抗肿瘤药物研发的必然方向。如果一种药物被批准作为某个适应症的一线疗法,并取代了既往标准治疗药物,则将其归类为一线替代药物(first-line displacing durgs);如果获批药物与既往获批的药物联合治疗使用,或者如果药物获批用于辅助或维持治疗,则将其归类为补充治疗药物(add on therapy)。在药物研究中探索应用替代或补充药物治疗策略对疾病进行治疗,已经成为药物研究的重点之一,尤其是在抗肿瘤的药物研发过程中。

 

 

摘要:复发性功能获得性 JAK2V617F 突变赋予造血细胞不依赖生长因子的增殖,并且是骨髓增殖性肿瘤 (MPN) 发病机制的主要原因。大多数接受 JAK1/2 抑制剂鲁索替尼治疗的患者缺乏完全反应表明需要确定新的治疗策略。二甲双胍是一种双胍类药物,在血液恶性肿瘤中发挥选择性抗肿瘤活性。在本研究中,作者研究和比较了二甲双胍和鲁索替尼单独和联合对 JAK2V617F 阳性细胞中细胞信号传导和细胞功能的影响。在表达 JAK2V617F 的细胞系中,二甲双胍治疗显着降低了细胞活力、细胞增殖、克隆形成和细胞耗氧量,并延迟了细胞周期进程。与单一疗法相比,二甲双胍加鲁索替尼显示出更强烈的细胞活力降低和细胞凋亡诱导。值得注意的是,二甲双胍降低了 Jak2V617F 敲入诱导的 MPN 小鼠的 Ba/F3 JAK2V617F 肿瘤负荷和脾肿大。总之,二甲双胍在 MPN 中发挥多靶点抗白血病活性:下调 JAK2/STAT 信号传导和线粒体活性。作者探索性研究建立了二甲双胍和鲁索替尼作用的新分子机制,并为开发MPN替代/补充治疗策略提供了见解。

 

结果:在用鲁索替尼(Ruxolitinib)和/或二甲双胍(Metformin)处理 24 小时后,使用O2k测定 HEL、SET2 或 Ba/F3 JAK2V617F 细胞中的耗氧量。下图包含 ROUTINE、LEAK、ETS 和 ROX 状态下的耗氧量的曲线图。结果显示二甲双胍单独处理或鲁索替尼与二甲双胍联合处理,都显著降低了耗氧量。

 

参考文献:Machado-Neto, et al. Metformin exerts multitarget antileukemia activity in JAK2V617F-positive myeloproliferative neoplasms. Cell Death Dis 9, 311 (2018). https://doi.org/10.1038/s41419-017-0256-4