奥地利OROBOROS 基因治疗临床前有效性评价应用解决方案
基因治疗（gene therapy）是将正常基因导入患者的机体细胞中，以取代突变基因；或产生功能性蛋白，恢复细胞的正常功能，达到治疗疾病的目的。线粒体是细胞生命活动的能量工厂，是几乎所有真核生物都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖类、脂肪和氨基酸等物质的氧化释放能量的场所，对维持生物体正常生理功能至关重要；线粒体功能障碍是许多人类疾病的标志，如癌症、糖尿病、高血压、肌肉减少症、肌肉萎缩症、心力衰竭、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症、帕金森症、慢性肾病、巴氏综合症、亨廷顿舞蹈症等多种疾病的发生发展都与线粒体功能障碍密切相关。因此，线粒体功能改善可以用于基因治疗产品有效性评价的重要参考。
GENE THERAPY
PRECLINICAL
EFFECTIVENESS EVALUATION
APPLICATION SOLUTIONS
什么是基因治疗？
基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的，也就是通过基因转移技术将外源基因插入患者适当的受体细胞中，使外源基因表达的产物能治疗某种疾病。目前，全球估计有800种基因疗法正处于研发阶段，这些疗法可以治疗的疾病也已经由单基因遗传病逐步拓展到恶性肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等重大疾病。
基因治疗临床前有效性评价为什么要关注细胞器线粒体？
2021年11月，中国国家食品药品监督管理局药审发布《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）》，其中提到：基因治疗产品(Gene Therapy Products)应开展系统的非临床研究，评估safe性风险，验证有效性机制，以支持开展相应临床试验及上市。其中：基因治疗产品药理学研究是为了在体内、体外研究产品与治疗靶点相关的作用机制和效应，明确基因治疗产品的生物学作用特点；同时提到通过对动物表型、导入基因的体内表达及其功能活性相关的生物标志物等进行检测以说明基因治疗产品的有效性和/或safe性。基因治疗产品通常是将正常基因导入患者的机体细胞中，以取代突变基因；或产生功能性蛋白，恢复细胞的正常功能，达到治疗疾病的目的。线粒体是细胞生命活动的能量工厂，是几乎所有真核生物都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖类、脂肪和氨基酸等物质的氧化释放能量的场所，对维持生物体正常生理功能至关重要；多种疾病的发生发展都与线粒体功能障碍密切相关。因此，线粒体功能改善可以用于基因治疗产品有效性评价的重要参考。
线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统是线粒体呼吸代谢的中心，是真核细胞能量产生的关键。支持OXPHOS系统运转的是电子传递链（ETC）的上五种酶复合体：复合体I（CI），复合体II（CII），复合体III（CIII），复合体IV（CIV），由复合体I-IV生成的质子梯度随后被复合体V（ATP合酶）所利用，催化ADP磷酸化生成ATP。OXPHOS系统中任何一个复合体发生变化或异常都会引起线粒体功能障碍，影响线粒体能量工厂的正常运转，因此通过检测OXPHOS系统各复合体功能活性来评估线粒体氧化磷酸化功能，将为基因治疗有效性评价带来重要参考指标，但如何快速检测分析OXPHOS各复合体的功能活性，是评估线粒体氧化磷酸化功能的技术难点。目前对OXPHOS各复合体的功能活性的检测，主要是采用比色法，操作时间长，步骤多，只能对单个复合体功能活性进行检测分析，无法一次性检测分析同一样本各复合体功能活性。
OROBOROS O2k高精度氧化磷酸化功能表征系统
Oroboros O2k拥有一次性同时快速检测氧化磷酸化各复合体的功能活性的技术特点：Oroboros O2k提供了一种独特的SUIT（底物-解偶联剂-inhibitor-滴定，Substrate-uncoupler-inhibitor-titration）检测方案来检测线粒体氧化磷酸化各复合体的功能活
Oroboros O2k没有加药孔的限制，也没有试剂盒的限制，可以根据实验设计灵活的不限制的添加底物、inhibitor、解偶联剂及不同浓度的药物滴定，实现同一个样本一次性快速进行复合物I、复合物II、复合物IV、呼吸率、ATP合酶的功能活性检测，深度挖掘线粒体能量代谢信息，快速评估和表征线粒体氧化磷酸化各复合体功能活性，从而加速靶向线粒体氧化磷酸化药物研发的进展。
除了具备无限制加药特点，Oroboros O2k基因治疗有效性评价在线粒体呼吸代谢方面多维度检测方案：
（1）光电联合多参数实时动态检测技术：
电化学实时动态检测模块：pO2（高分辨率Polarographic oxygen electrode传感器，耗氧率检测分辨率为±1 pmol O₂∙s⁻¹∙mL⁻¹）、pH、H2O2、TPP+（测量线粒体膜电位）、H2S、NO、质体醌；
荧光实时动态检测模块：MMP（测量线粒体膜电位）、ATP、Ca2+、ROS、NADH；
（2）独有的原代细胞、原代组织线粒体呼吸代谢快速检测技术：无需过夜培养、样品快速检测，更加客观反映样品更接近体内的线粒体呼吸代谢水平；
（3）独有的多维度生物体呼吸代谢分析平台：适应线粒体、细胞、组织块、活检样品等不同层次不同水平的样本检测。
案例一：O2k在心血管病基因治疗领域的应用
关键词：线粒体、CI（复合体I）、CII（复合体II）
引言：在这篇文献中作者为了以快速有效的方式筛选新的线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）inhibitor，开发并改进了一种使用冷冻保存剂海藻糖对分离的线粒体进行冻融并保持线粒体活性功能的方法，然后用O2k测量线粒体耗氧量变化，通过分析线粒体在ADP存在（III态呼吸）与否（IV态呼吸）的情况下溶解氧的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），从而评估线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率在不同冻存时间的一致性。
摘要：心力衰竭是心血管疾病主要的死亡原因。心脏肥大是充血性心力衰竭的主要危险因素。消除心脏肥大进展是公认的治疗目标。线粒体功能障碍是许多人类疾病的标志，包括心脏肥大和心力衰竭。寡霉素敏感性赋予蛋白（OSCP）是 F1Fo-ATP合酶的关键成分，在线粒体呼吸代谢中起重要作用。然而，OSCP靶向治疗对心脏肥大的影响仍然未知。在本研究中，作者发现OSCP的心脏表达受损伴随着心脏肥大的线粒体功能障碍。腺相关病毒9型介导的心脏特异性OSCP过表达可以通过改善线粒体功能来保护心脏。该结果可能为心脏肥大和心力衰竭的新疗法提供见解。
结果：作者使用心脏特异性、腺相关病毒介导的OSCP基因疗法来治疗经由横向主动脉缩窄（TAC）引起的压力超负荷的小鼠。通过O2k评价经OSCP基因治疗后的TAC小鼠的线粒体呼吸能力是否有显著性增强：数据显示OSCP过表达显著上调了常规线粒体呼吸能力，线粒体的磷酸化呼吸能力（OXPHOS CI+CII）和电子传递系统非耦合呼吸能力（ETS CI+CII）也显著升高。同时OSCP基因治疗保护TAC小鼠免受心肌细胞肥大和纤维化。
参考文献：Guo Y, et al. Sustained Oligomycin Sensitivity Conferring Protein Expression in Cardiomyocytes Protects Against Cardiac hypertrophy Induced by Pressure Overload via Improving Mitochondrial Function. Hum Gene Ther. 2020 Nov;31(21-22):1178-1189.
案例二：O2k在基因治疗预防抗肿瘤药物心脏毒性的应用
关键词：线粒体、复合体I
引言：近年来，抗肿瘤药物治疗进步迅速，显著延长了肿瘤患者的生存期，但是因抗肿瘤药物治疗所引起的心脏毒性却增加了患者心血管疾病的发病率和死亡率。对于抗肿瘤药物心脏毒性的高危患者或已发生心脏毒性的患者，按目前心内科HF等相关指南治疗效果并不理想，这可能与抗肿瘤药物对心肌的损伤与一般心脏疾病的心肌损伤机制不同有关。寻找更好的治疗方法及药物就成了解决问题的关键所在。
摘要：蒽环类抗生素多柔比星 (DOX) 用于治疗多种癌症，但其效用受限于其累积的心脏毒性。但是目前减轻 DOX 心脏毒性的手段是有限的。作者认为促进冠状动脉生成、生理性心脏肥大和缺血抵抗的血管内皮生长因子-B (VEGF-B) 可能是预防 DOX 诱导的心脏毒性的候选者。结果显示，VEGF-B 基因治疗完全restrain了 DOX 诱导的心脏萎缩和全身消瘦，并且改善了心脏线粒体呼吸能力。VEGF-B 基因治疗可以为预防癌症患者化疗引起的心脏毒性提供一种新的治疗可能性。
结果：在DOX治疗前1周向正常和荷瘤小鼠进行了VEGF-B基因治疗，使用了表达VEGF-B的腺相关病毒载体或对照载体，使用的剂量模拟了诊所中使用的浓度。通过O2k来评价VEGF-B基因治疗对心脏线粒体功能的影响，VEGF-B基因治疗增加了DOX处理的心脏中的线粒体耗氧量，复合体I功能活性和非耦合呼吸（ETS CI+CII）显著增强。VEGF-B基因治疗减少了DOX处理的心脏线粒体的萎缩，同时VEGF-B基因治疗增加了DOX诱导的心肌细胞大小。
参考文献：Räsänen M. et al. VEGF-B gene therapy inhibits doxorubicin-induced cardiotoxicity by endothelial protection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 15;113(46):13144-13149. doi: 10.1073/pnas.1616168113.
案例三：O2k在神经退行性疾病基因治疗领域的应用
关键词：线粒体
引言：神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，包括帕金森疾病、阿尔兹海默病、亨廷顿氏病等；目前这类疾病病因尚不明确，并无有效治愈手段，且严重威胁着患者的生活质量。目前大多数用于神经退行性疾病的药物只能延缓病情发展，没有办法扭转或者根治这类疾病，基因治疗则为实现这一目标带来希望。
摘要：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常见的神经退行性疾病，没有治愈或有效治疗。本研究探讨酵母内部NADH-醌氧化还原酶（NDI1）能否在功能上替代有缺陷的哺乳动物线粒体复合体I，这可能为治疗线粒体复合体I功能障碍引起的散发性PD提供基因治疗策略。本研究结论是酵母NDI1可以修复鱼藤酮诱导的PD细胞和小鼠模型中的氧化磷酸化缺陷，改善神经行为和神经病理损伤。该研究结果可为酵母NDI1基因治疗线粒体复合物I功能障碍所致散发性PD提供依据。
结果：通过O2k来评价NDI1基因治疗鱼藤酮诱导的PD细胞模型中线粒体氧化磷酸化功能的影响：NDI1基因治疗显著增加了鱼藤酮诱导的PD细胞模型中线粒体基础耗氧量（Base）、耗氧量（FCCP）、线粒体 ATP 合酶偶联的呼吸控制率 (RCR)；NDI1基因治疗显著减少了鱼藤酮诱导的PD细胞模型中线粒体质子泄漏的泄漏控制率 (LCR)。同时NDI1基因治疗增加了鱼藤酮诱导的PD细胞模型中细胞突起及多巴胺能神经元细胞数量。
参考文献：Li, H. et al. Gene therapy of yeast NDI1 on mitochondrial complex I dysfunction in rotenone-induced Parkinson’s disease models in vitro and vivo. Mol Med 28, 29 (2022).
案例四：O2k在遗传性疾病基因治疗领域的应用
关键词：纤维束组织
引言：传性疾病是由于人体内遗传物质改变所引起的疾病，目前已知的人类遗传病超过 6000 种，单基因遗传病 3200 种，其中百分之 95 以上的遗传疾病都无有效的治疗方法。替代疗法中，传统的小分子或者酶等药物能够在一定程度上缓解患者的痛苦，但此种治疗方法需要持续给药，加重了患者的经济和心理负担，同时，药物不仅不能从根本上治疗遗传类疾病，还会引起严重的并发症。基因治疗为传统疗法无效的遗传性疾病提供了新的治疗希望。
摘要：杜氏肌营养不良症（DMD）是由于X染色体上编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的DMD基因出现突变而导致的X连锁遗传性疾病，其发病原因在于DMD基因突变，导致肌营养不良蛋白产生不足，而肌营养不良蛋白是维持肌肉膜稳定和功能所必需的，一旦缺乏就会导致进行性肌肉退化和萎缩。本研究假设自愿轮跑将补充肌营养不良蛋白基因疗法以改善年轻 mdx（杜氏肌营养不良模型）小鼠的肌肉功能。结果显示在年轻的 mdx 小鼠中，自愿轮跑与肌营养不良蛋白基因治疗相结合可以改善全身状况，恢复肌肉功能，增强线粒体呼吸能力。随着目前临床试验中的肌营养不良基因治疗的开展，这些数据可能有助于我们了解运动对治疗DMD患者的潜在影响。
结果：通过O2k来评价肌营养不良基因治疗和自愿轮跑 mdx小鼠股四头肌线粒体呼吸能力的影响，数据显示mdxGT基因治疗明显改善了mdx的线粒体呼吸能力，mdxRGT补充了肌营养不良基因治疗以提供生物能量益处；同时mdxGT基因治疗增加了肌营养不良蛋白含量，明显改善了肌肉组织病理学形态特征。
参考文献：Hamm SE. et al. Voluntary wheel running complements microdystrophin gene therapy to improve muscle function in mdx mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 Mar 3;21:144-160.
案例五：O2k在线粒体疾病基因治疗领域的应用
关键词：细胞
引言：线粒体病（mitochondrial disease）是指由于线粒体DNA或核DNA缺陷引起线粒体氧化磷酸化功能障碍为特点的一组遗传性疾病，不包括其他因素导致的继发性线粒体功能障碍性疾病。常累及多个器官和系统，其中以神经和肌肉的病变为主要表现。线粒体病目前尚无治疗方法，主要是进行对症治疗和药物治疗。线粒体基因治疗通过特定的线粒体靶向序列运输到线粒体，以恢复缺失或缺陷的线粒体功能，从而有望根治线粒体病。
摘要：线粒体疾病如Leber遗传性视神经病变（Leber hereditary optic neuropathy，LHON）是一种由线粒体DNA突变所引起的母系遗传性视神经萎缩。其主要临床表现为双眼先后发生的无痛性视力突然急剧下降，疾病早期视盘充血、毛细血管扩张，进展至后期视神经萎缩。目前临床上常使用支持疗法和神经营养疗法两种方法治疗LHON，但疗效均不理想。线粒体基因治疗有望根治此类疾病。研究者用重组人线粒体转录因子 A (rhTFAM)联合健康供体mtDNA基因治疗处理含有突变mtDNA的LHON细胞，结果显示改善了线粒体呼吸的机制。短期内线粒体复制、转录和翻译相关的关键基因和蛋白质表达增加。这些结果将为LS 患者开发线粒体基因治疗方法提供了数据支持。
结果：通过O2k来评价TFAM联合健康供体mtDNA基因治疗对LHON细胞线粒体呼吸能力的影响，数据显示常规耗氧率（Routine）、质子泄漏率（Leak）比CTL显著增加，呼吸率也有增加，数据显示TFAM联合健康供体mtDNA基因治疗对LHON细胞线粒体呼吸能力有明显改善。
参考文献：Iyer S. et al. Mitochondrial gene therapy improves respiration, biogenesis, and transcription in G11778A Leber's hereditary optic neuropathy and T8993G Leigh's syndrome cells. Hum Gene Ther. 2012 Jun;23(6):647-57.
