案例一：

 

衰老与阿尔兹海默症

五参数多维度能量代谢检测

实验：内源性嘌呤GUO保护神经组织，抵抗AβOs的毒性损伤实验

pO2（耗氧率）、RCR（呼吸控制比率）、ROS（活性氧）、ATP（三磷酸腺苷）、Ca2+（钙离子）

 

     

阿尔茨海默病 (AD) 是一种神经退行性疾病，会导致记忆力减退、认知障碍和情绪障碍。随着全球人均寿命的延长，阿尔兹海默症的患病率逐年增加，截止目前，阿尔兹海默症的发病原因仍然成迷，其致病原因可能与遗传、环境有关，随着患病率的上升，我们迫切需要开发新的预防与治疗方法。触体是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。使用淀粉样蛋白 β 寡聚体 (AβOs)的ICV注射入小鼠脑内，形成AD小鼠模型，口服GUO（鸟苷）用于评估嘌呤对神经线粒体的保护作用。

淀粉样-β寡聚物(a β os)毒性引起线粒体功能障碍，导致阿尔茨海默病(AD)的突触功能衰竭。考虑到突触前的高能量需求和严格的Ca2+调节，线粒体功能的损害可导致神经活动恶化和细胞死亡。本研究采用脑室内注射AβOs诱导AD小鼠模型，研究AβOs对AD小鼠突触前功能的毒性作用。以鸟苷(GUO, guanosine)为治疗手段，观察其对AD模型的神经保护作用。模型诱导24 h和48 h后，分别进行行为任务和生化分析。AβOs损害物体识别(OR)短期记忆，降低海马谷氨酸摄取和氧化。此外，AβOs降低备用呼吸能力，降低ATP水平，损害Ca2+处理，并导致海马突触体线粒体肿胀。鸟苷通过血脑屏障，恢复OR短期记忆，重建谷氨酸摄取，恢复线粒体Ca2+稳态，并部分防止线粒体肿胀。因此，这种内源性嘌呤对突触前线粒体具有神经保护作用，值得在AD模型中进一步研究。

 

案例二：

 

衰老与骨骼肌

活检样本双参数多维度能量代谢检测

实验：Nrf2缺失导致线粒体功能障碍，引起肌肉减少

 

 

     

与年龄相关的骨骼肌质量损失和收缩功能障碍，降低了老年人的独立性和生活质量，并导致与慢性疾病共病的风险增加。我们之前的研究证实，线粒体活性氧(ROS)生成增加和氧化损伤发生在肌肉萎缩中，并与萎缩程度相关。

先前的研究表明，幼(2-3个月大)Nrf2-/-小鼠在后肢骨骼肌去神经后，与野生型小鼠相比，抗氧化反应减少，氧化损伤水平增加。幼龄(5月龄)Nrf2-/-小鼠的骨骼肌在大外力下、达到峰值张力的时间或原位半松弛时间方面没有差异，但与野生型对照组相比，其骨骼肌疲劳增加，与ROS生成增加相关。先前的研究表明，年龄(23-24个月)Nrf2-/-小鼠的骨骼肌基础和运动诱导的抗氧化酶水平降低，肌肉干细胞数量减少，ROS生成增加，氧化应激、泛素化蛋白和凋亡信号传导。这些数据表明，Nrf2在衰老期间的肌肉稳态中发挥重要作用。

本研究中假设老年小鼠骨骼肌中Nrf2缺失会通过线粒体功能障碍、细胞氧化还原平衡失调、氧化损伤水平增加和收缩功能障碍导致骨骼肌减少表型。为了验证假设，研究人员测量了幼年(4个月)野生型和成年(24个月)野生型和Nrf2-/小鼠的骨骼肌中的这些参数。我们的数据显示，与年龄匹配的野生型小鼠相比，老Nrf2-/-小鼠的肌肉质量和收缩力产生减少，与线粒体耗氧量减少、线粒体ROS生成增加、蛋白质亚硝基化增加、细胞氧化还原失调和乙酰胆碱受体表达减少有关。

本研究为骨骼肌Nrf2在骨骼肌减少症发病机制中发挥保护作用提供了证据。

4 实验结果

         

          A、实验结果耗氧率、ROS变化曲线图

随着不同试剂的加入，针对骨骼肌内线粒体的各个复合物进行了耗氧率观察，同时伴随的活性氧的产出情况

           B、实验结果数据柱形图对比

结果中显示，再老化小鼠以及Nrf2缺乏衰老小鼠中，复合物I出现了明显的下降，同时活性氧明显上升

 

 

 

 

 

1 样本制备-活检骨骼肌

         本研究中选择活检骨骼肌样本，骨骼肌透化纤维的制作方法。

         

 

 

 

2 实验方案设计-O2k的检测参数选择

 

       ★  pO2（耗氧率）

            RCR（呼吸控制比率）

            pH（产酸率）

            MMP（线粒体膜电位）

       ★  ROS（活性氧）

            ATP（三磷酸腺苷）

            Ca2+（钙离子）

            NO（一氧化氮）

            H2S（硫化氢）

            TPP+（四苯基膦）

            NADH（辅酶I）

            CoQ（质体醌）

 

 

3 按照实验需求滴加相关刺激试剂

 

5 结论

 

       野生型小鼠衰老后ROS生成率不变，这与之前在老年小鼠(~32月龄)腓肠肌中使用相同制剂(通透性纤维)的观察结果一致。研究者已经证明，在分离出的线粒体中，老龄小鼠线粒体ROS生成速率增加，但这种差异可能是由于线粒体分离过程中损伤和选择偏差造成的。的确，内源性抗氧化剂可能仍然存在于通透性纤维的细胞质中，而不在孤立的线粒体中。Nrf2缺乏引起衰老Nrf2-/-小鼠纤维中ROS生成显著增加。与过量ROS一致，老化的Nrf2-/-腓肠肌中酪氨酸残基硝化上调，提示Nrf2缺乏引起的氮化应激。虽然我们没有检测到脂质过氧化的增加，但之前的研究报道老龄Nrf2-/-小鼠的氧化应激诱导脂质过氧化。我们使用Nrf2-/-异前列腺素评估了股四头肌的脂质过氧化，而之前的研究使用了腓肠肌的免疫印迹。随着年龄的增长，线粒体OCR不变，但Nrf2缺乏显著降低了线粒体复合体I的呼吸。这与Nrf2-/-中NAD+/NADH比例的增加有关，这可以解释通过底物(NADH)浓度的降低，复合物I连接的OCR减少。这一发现与Nrf2缺失导致NADH脱氢酶铁硫蛋白3 (Ndufs3) mRNA表达减少有关，该mRNA在呼吸系统中复合物I向其他复合物的电子运输中起重要作用。

 

案例三：

 

衰老与肝脏

双样本双参数多维度能量代谢检测

实验：胱甘肽对外源毒性引起线粒体复合物Ⅰ损伤的预防作用

     

       线粒体谷胱甘肽(mGSH)在年龄相关的外源性毒性易感性增强中的作用尚不明确。我们测定了300 μM甲萘醌处理幼龄和老年F344大鼠肝细胞的mGSH状态和线粒体生物能量指数，该浓度可导致老年细胞百分之50死亡。在此浓度下，mGSH仅在老年大鼠的肝细胞中显著丢失，而且由于老年细胞中基础mGSH较低，几乎全部损耗。在衰老的肝细胞中，甲萘醌导致线粒体膜潜在崩溃，以及耗氧量和呼吸储备能力的显著不足，这是细胞生物能量恢复的指标。进一步的研究表明，甲萘醌介导的老年肝细胞呼吸储备能力的丧失是由于复合物I活性的显著restrain和质子泄漏的增加，而复合物II活性的增加并不能弥补这一损失。这些数据表明，线粒体对氧化还原循环挑战的易感性与年龄相关，特别是在Complex I活性方面，并提供了一种合理的机制来将这种易感性与mGSH扰动联系起来。

       过氧化和伴随而来的细胞活力丧失此外，谷胱甘肽依赖解毒的重要性通过提供谷胱甘肽合成的底物(n -乙酰- l-半胱氨酸)来弥补这种增加的脆弱性的能力得到了证明。虽然我们之前的研究表明，肝细胞对甲萘醌易感性的增加是通过年龄相关的谷胱甘肽本身的损失来介导的，但它没有研究不同的mGSH池在促进肝脏对氧化还原循环剂的易感性中的作用。为了填补这一重要的知识空白，目前工作的目标是确定年龄相关的mGSH缺陷是否与menadione介导的损伤的脆弱性有关。基于这一目标，我们假设年龄相关的对急性氧化还原循环挑战的脆弱性增加是由于mGSH能力无法维持线粒体ETC功能。为了验证这一假设，我们在从年轻和年老的雄性Fischer 344大鼠(F344)分离的肝细胞中使用急性甲喹酮剂量(300 μM)，并评估线粒体功能的年龄相关差异。除了上述随年龄增加的易损性外，其他研究表明甲萘醌直接与线粒体中的复合物I相互作用，耗尽mGSH，减少Δψm，诱导MPTP的形成。因此，甲萘醌是一种合适的模型毒素，可以用来探索与年龄相关的mGSH下降和线粒体功能丧失在氧化还原循环剂急性暴露反应能力下降中的作用。在本文中，我们发现，年龄相关的mGSH下降通过ETC Complex I活性的丧失增加了线粒体对急性甲萘醌暴露的脆弱性，伴随的是基础氧消耗和RRC的丧失，导致Δψm的崩溃。

      本研究为骨骼肌Nrf2在骨骼肌减少症发病机制中发挥保护作用提供了证据。

1 样本制备-原代肝细胞

         本研究中选择活检骨骼肌样本，骨骼肌透化纤维的制作方法。

         

 

2 实验方案设计-O2k的检测参数选择

 

       ★  pO2（耗氧率）

            RCR（呼吸控制比率）

            pH（产酸率）

       ★  MMP（线粒体膜电位）

            ROS（活性氧）

            ATP（三磷酸腺苷）

            Ca2+（钙离子）

            NO（一氧化氮）

            H2S（硫化氢）

            TPP+（四苯基膦）

            NADH（辅酶I）

            CoQ（质体醌）

 

 

3 按照实验需求滴加相关刺激试剂

 

5 结论

       我们的研究结果进一步表明，年龄增加了线粒体对急性氧化还原循环挑战的易感性，尤其是复合物I在暴露于氧化还原循环剂时更容易受到restrain。先前的研究已经证明了一种与年龄相关的向更氧化的线粒体环境的转变。这包括GSSG含量的增加以及线粒体蛋白的谷胱甘肽化。研究表明，当线粒体中mGSH在氧化条件增加时耗尽时，复合物I的51和75 kDa亚基上临界半胱氨酸残基发生可逆的谷胱甘肽化。这种混合二硫化物的产生可能会导致复合物I活性的基础损失、基础O2消耗和Δψm随年龄的增加而增加。此外，我们的实验室表明，glutaredoxin 2 (Grx2)的活性随着大鼠心脏线粒体的年龄下降，这是一种从氧化还原活性蛋白巯基(如复合物I上的那些)中去除谷胱甘肽的线粒体酶。其他报告显示，来自Werner综合征(一种以早衰为特征的疾病)患者的Grx2细胞也有类似的下降。我们之前的研究表明，仅维持GSH就可以弥补随年龄增长而出现的弹性丧失，以及mGSH调节复合物I活性的重要性，这些证据有力地表明，与年龄相关的mGSH丧失在线粒体致敏过程中发挥着关键作用。因此，这些结果提供了一个可能的机制，在衰老过程中mGSH氧化还原扰动和甲萘醌损伤，以及复合物I活性的显著下降。除了探索上述机制外，这项工作还将mGSH确定为年龄相关治疗的潜在靶点。我们之前的研究表明，硫辛酸治疗两周能够增加胞浆和mGSH。然而，由于硫辛酸在数天至数周内上调nrf2依赖的GSH合成基因，因此该方法并不直接适用于目前的急性探索。然而，硫辛酸以及其他诱导GSH合成的化合物(如n-乙酰半胱氨酸)可能是预防mGSH随年龄增长而丧失的一种长期选择，以限制线粒体对可能影响细胞器功能的外来生物的易感性。此外，我们正在利用一种新型化合物(正在申请专利)将谷胱甘肽定向到线粒体，从而避免细胞溶胶吸收缓慢或有限，这可能会随着年龄的增长而受限。这种策略可能作为一种介入手段，保护线粒体在急性亲电性损伤。

 

4 实验结果