奥地利OROBOROS 氧化还原研究应用解决方案
氧化还原（Reduction and Oxidation, Redox）反 应是生命活动中不可或缺的过程，它在生物体内主 要参与细胞代谢、能量的生成和调节、信号传导等 许多生物学过程，在生物体中扮演着非常重要的角 色。氧化还原反应的原理是利用氢离子的转移和电 子的转移来完成能量产生和维持生命活动。当生物 体内氧化还原反应的平衡被打破，导致氧化和还原 反应的速率不平衡，将引起一系列生理和病理变化。 线粒体是细胞生命活动的能量工厂，是几乎所有真 核生物都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行 氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖类、脂肪 和氨基酸等物质的最终氧化释放能量的场所，对维 持生物体正常生理功能至关重要。线粒体除了作为 细胞内能量生成的关键细胞器，还参与细胞凋亡、 自由基产生、脂质代谢等代谢过程，其功能障碍与 癌症、糖尿病、心力衰竭、动脉粥样硬化、阿尔兹 海默症、帕金森症等多种疾病的发生发展密切相关。 由此可见，氧化还原反应与线粒体能量代谢有着密 不可分的内在联系。
APPLICATION SOLUTION FOR OXIDATION-REDUCTION RESEARCH
氧化还原研究为什么要关注线粒体？
氧化还原（Reduction and Oxidation, Redox）反应是生命活动中不可或缺的过程，它在生物体内主要参与细胞代谢、能量的生成和调节、信号传导等许多生物学过程，在生物体中扮演着非常重要的角色。
氧化还原反应的原理是利用氢离子的转移和电子的转移来完成能量产生和维持生命活动。当生物体内氧化还原反应的平衡被打破，导致氧化和还原反应的速率不平衡，将引起一系列生理和病理变化。
线粒体是细胞生命活动的能量工厂，是几乎所有真核生物都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖类、脂肪和氨基酸等物质的最终氧化释放能量的场所，对维持生物体正常生理功能至关重要。
线粒体除了作为细胞内能量生成的关键细胞器，还参与细胞凋亡、自由基产生、脂质代谢等代谢过程，其功能障碍与癌症、糖尿病、心力衰竭、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症、帕金森症等多种疾病的发生发展密切相关。由此可见，氧化还原反应与线粒体呼吸代谢有着密不可分的内在联系。
线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统是线粒体呼吸代谢的中心，是真核细胞能量产生的关键。支持OXPHOS系统运转的是电子传递链（ETC）的上五种酶复合体：复合体I（也称CI或NADH：泛醌氧化还原酶），复合体II（也称CII或琥珀酸脱氢酶SDH），复合体III（也称CIII或细胞色素bc1氧化还原酶），复合体IV（也称CIV或细胞色素c氧化酶），由复合体I-IV生成的质子梯度随后被复合体V（ATP合酶）所利用，催化ADP磷酸化生成ATP。线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统除了产生细胞生命活动的直接能源ATP外，还负责细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。ROS是高反应性氧化物，有一个或多个不成对的自由基电子，性能十分不稳定，可随时氧化其他分子。生理水平的ROS可作为细胞内的信号分子，通过氧化修饰靶蛋白的肽键和侧链，使靶蛋白的构象和活性位点发生改变，导致其蛋白结构和功能发生变化，从而调控细胞生长、增殖和凋亡等，并与ROS防御系统维持氧化-抗氧化平衡。
在生理条件下，OXPHOS系统复合体I（CI）和复合体III（CIII）是ROS的主要来源；在病理条件下，OXPHOS系统中任何一个复合体发生变化或功能障碍都与ROS的产生密切相关。如：复合体II（CII）在癌症或神经退行性疾病等病理情况下会产生ROS；复合体IV（CIV）功能障碍也会导致复合体III（CIII）产生ROS。过量的ROS则会引起细胞氧化-抗氧化稳态失衡，引发氧化应激反应。
ROS 与癌症：与癌症相关的一些不利因素 (压力、烟草、环境污染物、辐射、病毒感染、饮食和细菌感染) 都能通过产生 ROS 与细胞相互作用，激活各种转录因子，导致控制炎症、细胞转化、肿瘤细胞存活、肿瘤细胞增殖和侵袭、血管生成和转移的蛋白表达。
ROS 与心血管疾病：心肌细胞有大量的线粒体，它们更容易受到氧化损伤。另外，氧化应激还可导致 eNOS 失调和血管内皮功能障碍，这与其他涉及诱导线粒体功能障碍和诱导大分子损伤的 ROS 一起，参与了心血管疾病的发病和进展，如动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭和外周动脉疾病。
ROS 与神经退行性疾病：衰老被认为是神经退行性疾病的主要风险因素，衰老过程中累积的氧化损伤是神经系统恶化的主要原因。线粒体功能丧失，金属稳态改变，不活跃的氧化防御机制等会直接影响神经元的突触活动和神经传递，从而导致认知功能障碍。
线粒体氧化磷酸化各复合体功能活性评估联合ROS实时检测方法存在的困难
OXPHOS系统中任何一个复合体发生异常或功能障碍，都会极易产生过量的ROS并且进一步导致线粒体发生功能障碍，因此通过实时同步检测OXPHOS系统各复合体功能活性及其ROS来多维度评估线粒体氧化磷酸化功能，将为深入研究线粒体在氧化还原应激中的分子作用机制带来重要参考。但如何实时同步快速检测分析OXPHOS各复合体的功能活性及其ROS产生，是多维度评估线粒体氧化磷酸化功能活性的技术难点。目前对OXPHOS各复合体的功能活性及其ROS的检测，主要是采用比色法，操作时间长，步骤多，只能对单个复合体功能活性进行终点法的检测分析，并且不能同时检测ROS，无法一次性实时同步动态检测分析 同一样本各复合体功能活性及其相关的ROS检测。
OROBOROS O2k高精度氧化磷酸化功能表征系统
Oroboros O2k拥有的一次性同时快速检测氧化磷酸化各复合体的功能活性的技术特点：Oroboros O2k提供了一种独特的SUIT（底物-解偶联剂-inhibitor-滴定，Substrate-uncoupler-inhibitor-titration）检测方案来检测线粒体氧化磷酸化各复合体的功能活性“”
Oroboros O2k没有加药孔的限制，也没有试剂盒的限制，可以根据实验设计灵活的不限制的添加底物、inhibitor、解偶联剂及不同浓度的药物滴定，实现同一个样本一次性快速进行复合物I、复合物II、复合物IV、呼吸率、ATP合酶的功能活性检测，深度挖掘线粒体能量代谢信息，快速评估和表征线粒体氧化磷酸化各复合体功能活性，从而加速靶向线粒体氧化磷酸化药物研发的进展。
Oroboros O2k光电联合多维度生物体呼吸代谢分析整体解决方案：
（1）光电联合多参数实时动态检测技术：
电化学实时动态检测模块：pO2（高分辨率Polarographic oxygen electrode传感器，耗氧率检测分辨率为±1 pmol O₂∙s⁻¹∙mL⁻¹）、pH、H2O2、TPP+（测量线粒体膜电位）、H2S、NO、质体醌；
荧光实时动态检测模块：MMP（测量线粒体膜电位）、ATP、Ca2+、ROS、NADH；
（2）独有的原代细胞、原代组织线粒体呼吸代谢快速检测技术：无需过夜培养、样品快速检测，更加客观反映样品更接近体内的线粒体呼吸代谢水平；
（3）独有的多维度生物体代谢分析平台可进行多样本检测：适应线粒体、细胞、组织块、活检样品等不同层次不同水平的样本检测。
案例一：鱼类心脏中肌红蛋白、有氧能力、一氧化氮合酶活性和线粒体功能之间的关系
引言：一氧化氮（NO）是一种气体传递物质，通常由酶一氧化氮合酶（NOS）催化的反应产生，该反应需要O2氧化L-精氨酸，并涉及多种辅因子，如四氢生物蝶呤（H4B）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）。然而，组织中的NO水平也受到涉及含金属的氧结合蛋白（例如肌红蛋白，Mb）的反应的影响。在正常氧含量条件下，与氧结合的肌红蛋白（氧合肌红蛋白）与NO反应形成亚甲基肌红蛋白和硝酸盐，而在缺氧/无氧条件下，脱氧肌红蛋白作为亚硝酸盐还原酶，将亚硝酸盐还原为NO。在心脏线粒体水平上，这种动态的NO-Mb循环驱动呼吸的可逆调整，并根据细胞内氧张力优化氧气利用，同时控制自由基的水平。NO可以可逆地与复合物-IV（CIV）结合，并导致复合物-I（CI）的S-亚硝化，从而调节线粒体的氧气消耗和产生活性氧物质（ROS）。例如，最近的研究表明，CI的S-亚硝化会降低淡水龟Trachemys scripta心脏线粒体中的ROS产生和CI活性。因此，缺乏NO清除剂肌红蛋白可能对ROS的产生和CI能力产生重要影响。
摘要：肌红蛋白 (Myoglobin, Mb) 和一氧化氮 (Nitric Oxide, NO) 在心血管系统中的动态相互作用引起了广泛关注。一些氧合性鱼类心脏中的Mb损失提供了一个独特的机会，用于评估这种球蛋白在一氧化氮稳态和线粒体功能中的作用。研究者测量了三种氧合性鱼类心脏中的Mb含量、一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS) 和柠檬酸合酶 (Citrate Synthase) 酶活性，以及线粒体参数（复合物-I和-I+II呼吸、偶联效率、活性氧产生/释放速率和线粒体对一氧化氮抑制的敏感性，即NO IC50）。结果显示，Mb的表达与NOS活性和NO IC50呈正相关。与Mb表达的大西洋鲑 (Salmo salar) 和短角鲉 (Myoxocephalus scorpius) 相比，无Mb的大嘴鲱鱼 (Cyclopterus lumpus) 具有较低的NOS活性和降低的NOIC50。总体而言，数据显示，一氧化氮水平经过精细调节，以保持一氧化氮稳态和线粒体功能。在没有Mb的物种中，还表明存在补偿性机制来严格调节一氧化氮水平和线粒体功能，并强烈暗示线粒体对氧化磷酸化的NO IC50与鱼类对低氧耐受性密切相关。
结果：
本研究探讨了肌红蛋白的存在与否是否与氧化能力以及心肌和线粒体中NOS/NO系统的相关性。总体而言，与肌红蛋白阳性的大西洋鲑鱼和短角鲉相比，肌红蛋白阴性的大嘴鲱鱼在NOS活性方面减少，同时在对一氧化氮的敏感性上升（至少在线粒体水平上）。这些对一氧化氮的线粒体敏感性调整和心脏NOS活性的变化可能是为了弥补肌红蛋白的丧失（在心脏组织中是重要的一氧化氮清除剂和产生物），并确保线粒体功能在不同条件下得到精确调节。这个使用具有不同肌红蛋白含量的Hb+物种的比较研究极大地丰富了我们对全球蛋白和一氧化氮之间动态复杂关系的认识，并进一步深入了解心脏如何应对氧气供应的限制。
研究结果表明，肌红蛋白的存在与否对鱼类心脏中NOS活性和线粒体对一氧化氮的敏感性产生影响。缺乏肌红蛋白的情况下，心脏NOS活性下降，线粒体对一氧化氮的敏感性增加，可能是为了弥补肌红蛋白的丧失，确保心脏线粒体在不同条件下能够精确调节功能。这项研究对于我们深入了解肌红蛋白、有氧能力、一氧化氮合酶活性和心脏线粒体功能之间的关系提供了重要的见解，并有助于揭示鱼类心脏如何应对不同环境条件下的变化。
参考文献：Kamga C, Krishnamurthy S, Shiva S. Myoglobin and mitochondria: a relationship bound by oxygen and nitric oxide. Nitric Oxide. 2012 May 15;26(4):251-8.
案例二：敲除复合体III亚基Uqcrh会导致生物能量损伤和心脏收缩功能障碍
引言：成年哺乳动物心脏中ATP的产生依赖于氧化磷酸化过程（OXPHOS），该过程在电子传递系统（ETS）的促进下完成。ETS由复合体Ⅰ-复合体Ⅳ构成，具有促进脂肪酸、血红素及铁硫蛋白等化合物的合成；维持离子离子状态的平衡及产热等功能。因此，线粒体与心脏收缩力相关联并不奇怪，且线粒体是改善哺乳动物心脏收缩力衰竭的治疗靶点。复合物Ⅲ（C Ⅲ）的功能在发病机制中具有特别重要的意义，它能催化电子从辅酶Q（CoQ）向细胞色素c传递。在这过程中，泛醇细胞色素c还原酶链蛋白（Uqcrh）起调节作用，Uqcrh在不同的组织中广泛表达，其功能似乎对具有高能量代谢的器官显得特别重要。
摘要：临床报道在两名儿科病人身上发现了Uqcrh的双外显子删除现象，他们的临床特点是反复出现严重的酮酸中毒、过量的血氨、低血糖和脑病症状，且伴随有C III功能受损的情况。对此，本研究探讨C III相关蛋白Uqcrh对机体线粒体呼吸代谢的影响，并利用Uqcrh-KO小鼠进行研究。Uqcrh-KO小鼠具有高血糖且寿命较短（约12周）的特点。与对照组相比，Uqcrh-KO小鼠左心室缩小及功能受损，如射血分数，分数缩短和心输出量；在Uqcrh-KO小鼠的发育及新陈代谢方面，其线粒体C Ⅲ功能受损并伴随着体重下降。因此，该研究连续测量Uqcrh-KO小鼠6、7、8、9周的经胸超声心动图（TTE），并使用NextGen-O2k对12周Uqcrh-KO小鼠左心室的线粒体进行检测。NextGen-O2k在本研究中测量了一个组合在两个独立的实验中，三个参数（线粒体呼吸能力、Q氧化还原态和ROS）的变化。
结果： ETS的损害，迫使心脏将新陈代谢转换为效率较低的糖酵解，同时启动可能导致心脏收缩功能障碍的重塑过程。在本研究中，研究人员对一个罕见的C III缺陷病展开研究，即利用Uqcrh-KO小鼠，探讨该蛋白对心脏形态、收缩功能和线粒体生物能量的影响。为了说明患者存在的系统性代谢信号，研究人员使用NextGen-O2k对小鼠左心室的线粒体开展功能评估。研究证明，Uqcrh-KO小鼠会诱发高血糖和发育迟缓，这在断奶后变得特别明显。以TTE为媒介的心脏几何形状评估证实左心室质量下降。此外，研究人员观察到壁厚和左心室内径的数值相对相似，但在某些情况下，8周和9周时达到统计学上的显著差异。这很可能是在Uqcrh-KO小鼠中观察到的低LV维度与生长停止和身体大小及质量的严重下降有关；心脏线粒体功能的评估显示Uqcrh-KO线粒体的呼吸能力明显下降，及其Q氧化还原状态呈现下降，表明其ETS功能受损。然而，在没有呼吸抑制剂的情况下，这种ETS损伤并没有与线粒体ROS的过度产生相关联，表明观察到的心脏收缩功能障碍主要是由ATP耗尽或氧化还原不平衡引起的，而不是ROS介导的细胞损伤或死亡。
参考文献：Spielmann N, Schenkl C, Komlódi T, et al. Knockout of the Complex III subunit Uqcrh causes bioenergetic impairment and cardiac contractile dysfunction. Mamm Genome. 2023;34(2):229-243.
案例三：在自组装蛋白酶体系统（PLs）中表达的白色念珠菌和耳念珠菌重组AOX的动力学特征和抑制剂敏感性
引 言： 在白色念珠菌和耳念珠菌中，替代氧化酶（AOX）在促进持续呼吸活动方面起着非常关键的作用，往往被应激条件激活，如抗真菌药物或氧化诱导剂的存在。为了分析各种纯化的AOX蛋白的动力学参数，使用了自组装的呼吸膜系统（PLs），Q10在PLs膜中循环，其线粒体复合体I（CI）氧化外部溶液中的NADH，将膜中的Q10还原为Q10H2，AOX再氧化Q10H2，将O2还原为水。本研究通过观察其Q10（Q池）的氧化还原平衡探究AOX活性对于念珠菌呼吸的影响以及AOX抑制剂对于PLs的呼吸抑制作用。
摘要：由念珠菌属引起的念珠菌病是医院环境中的严重威胁，是后天感染和死亡的主要原因。随着耐杀菌剂病原体的增加，全球范围内的发病率一直在上升，这表明需要更有效的抗真菌药物。膜结合酶替代氧化酶（AOX）促进对杀菌剂的对抗性，使其成为一个理想的治疗靶点。然而，AOX底物（泛素-10）的亲脂性阻碍了其在生理相关条件下的动力学特征。在这篇文章中，作者介绍了PLs中来自念珠菌的重组AOX的纯化和表达，确定了泛醌的动力学参数。PLs也被用于使用新型AOX抑制剂的剂量反应检测。这些信息对于未来开发新的念珠菌血症治疗方法至关重要。本研究通过以AOX为唯一限速酶的PLs的线粒体呼吸检测证明AOX促进白色念珠菌和耳念珠菌的有氧呼吸；AOX抑制剂对两种菌株具有抑制呼吸作用。
结果：本课题研究泛素-10（Q10）结合到PLs的AOX蛋白的动力学特征及其抑制剂敏感性。奥地利Oroboros O2K高精度线粒体氧化磷酸化功能表征系统检测结果提示，PLs中的有氧呼吸耗氧率由AOX蛋白引起，加入不同AOX蛋白抑制剂后观察其呼吸速率的下降程度，发现Collectochlorin B为最 有效的AOX蛋白抑制剂，可作为抑制念珠菌生长的有效抗菌剂。
参考文献：Copsey AC, Barsottini MRO, May B, Xu F, Albury MS, Young L, Moore AL. Kinetic characterisation and inhibitor sensitivity of Candida albicans and Candida auris recombinant AOX expressed in a self-assembled proteoliposome system. Sci Rep. 2021 Jul 20;11(1):14748.
案例四：脯氨酸在氧化磷酸化复合体I受到抑制时通过氧化支持线粒体ATP产生
关键词：脯氨酸、耗氧率、NADH、CoQ氧化还原态、线粒体膜电位
引言：脯氨酸（Proline，Pro）是人体的非必需氨基酸，对稳定生物大分子结构、降低细胞酸性以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。Pro被脯氨酸氧化酶（也称脯氨酸脱氢酶，ProDH）氧化为吡咯啉-5-羧酸（P5C）的过程中产生的电子转移至线粒体泛醌（CoQ），从而支持线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）。然而P5C的分解代谢依赖于氧化磷酸化复合体I（CI）活性，这是由于NAD+要求的。NextGen-O2k可以实时同步测量耗氧率、线粒体膜电位、NADH或CoQ氧化还原态，助利于多维度深入研究脯氨酸在线粒体呼吸代谢过程中的作用机制。
结果一：脯氨酸增加了肝脏和肾脏线粒体氧化磷酸化水平：
如下图，利用NextGen-O2k检测不同浓度Pro（0.25–10 mM）对小鼠肝脏和肾脏组织分离的线粒体耗氧率的影响，发现线粒体OXPHOS（氧化磷酸化）呈剂量依赖性增加，而存在谷氨酸（G）和苹果酸（M）以及添加分别β羟基丁酸（βOH）或衣康酸盐（Itac），线粒体OXPHOS在不同浓度Pro添加下的剂量依赖性变化消除。Gergely Pallag, et al. Proline Oxidation Supports Mitochondrial ATP Production When Complex I Is Inhibited. Int J Mol Sci. 2022, 23, 5111. https://doi.org/10.3390/ ijms23095111.
结果二：Pro增加了对耗氧率、线粒体膜电位和NADH的作用：
如下图A，Pro以不同浓度的剂量增加，逐渐引起线粒体膜电位极化；而进一步添加CI抑制剂Rot（图B）和CII抑制剂Atpenin A5（图C）并没有影响线粒体膜电位极化；当添加CIII抑制剂Myx时，完全抑制了Pro引起的线粒体膜电位极化；与线粒体膜电位数据检测一致，对线粒体实时同步检测耗氧率、NADH、Rhd123（线粒体膜电位），不同浓度Pro（0.25–5 mM）引起耗氧率（图F）、NADH（图G），线粒体膜电位极化（图H）呈现剂量依赖性增加，说明Pro支持OXPHOS。
结果三：ProDH抑制剂降低了CoQ还原态和耗氧率
如下图B和D，利用NextGen-O2k检测不同浓度ProDH抑制剂THFA（0.5–10 mM）对小鼠肝脏和肾脏组织分离的线粒体耗氧率的影响，发现线粒体OXPHOS呈剂量依赖性降低；利用NextGen-O2k对线粒体实时同步检测耗氧率（图F）、CoQ氧化还原态（图G）、Rhd123（线粒体膜电位）（图H），发现含有5 mM Pro的b相对于a或含不同浓度THFA的c、d、e，其耗氧率、CoQ还原态最高，而e则最低，说明Pro支持OXPHOS，而膜电位没有显著性的变化，说明Pro提供的电子都用于氧气的消耗。
结果四：Pro维持了ANT正常转运功能
如下图：腺苷酸转运蛋白（ANT）位于线粒体内膜上，正常状态下，ANT把ADP转运到线粒体基质，把ATP从线粒体基质中运出。利用NextGen-O2k对线粒体实时同步检测耗氧率（图A）、CoQ氧化还原态（图B）、Rhd123（线粒体膜电位）（图C），发现添加Pro与添加ANT抑制剂CAT两者数据相对比，Pro相对CAT增加了耗氧率、CoQ氧化态和线粒体膜电位去极化，维持了ANT正常转运功能。而CAT抑制了ANT的正常转运功能，显著增加了线粒体膜电位极化，耗氧率反而降低、CoQ还原态增加，说明细胞内产生了过量的电子，容易引起细胞发生氧化应激损伤。
参考文献：Gergely Pallag, et al. Proline Oxidation Supports Mitochondrial ATP Production When Complex I Is Inhibited. Int J Mol Sci. 2022, 23, 5111. https://doi.org/10.3390/ ijms23095111.
结果一
结果二
结果三
结果四
