案例一：O2k在阿尔茨海默病(AD)分子机制研究中的应用

引言：阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是老年人常见的神经系统变性疾病，是痴呆常见的病因。据世卫组织估计，目前全球有超过5500万人患有痴呆症。《2020中国阿尔茨海默病患者诊疗现状调研报告》指出，2020年中国60岁及以上人群有1507万痴呆症患者，其中阿尔茨海默病983万。其病理特征为进行性神经元丢失和生化异常，包括细胞外淀粉样β蛋白(Aβ)斑块沉积、tau过度磷酸化和线粒体功能障碍。

案例1.1：《β-淀粉样蛋白和tau协同作用三重转基因阿尔茨海默病小鼠氧化磷酸化系统》

关键词：AD，小鼠大脑皮质，线粒体，复合体I，复合体IV

摘要：阿尔茨海默病 (AD) 的特征是含有β-淀粉样蛋白斑块（Aβ）、神经原纤维缠结以及神经元和突触丢失。缠结形成已在tau转基因pR5小鼠中呈现，而 APP/PS2双转基因小鼠呈现β-淀粉样蛋白斑块Aβ，杂交产生TripleAD三重转基因小鼠，将两种病理结合在一个模型中，并进行了功能验证，发现主要与氧化磷酸化系统 (OXPHOS) 的复合体I和IV相关。值得注意的是，tau引起复合体I的失调，Aβ引起复合体IV的失调。

结果：O2k揭示了TripleAD小鼠大脑中线粒体OXPHOS的高度缺陷。测量野生型、APP/PS2和TripleAD、pR5小鼠大脑皮质中新鲜分离的线粒体的氧通量和消耗。在检测到内源性呼吸 (mito) 后，加入谷氨酸-苹果酸 (g/m) 以诱导状态4呼吸。ADP刺激状态3呼吸。在确定耦合呼吸后，添加FCCP测量呼吸容量。细胞色素 c (cyt c) 证明了线粒体膜的完整性。为了restrain复合物 I-III 的活性，添加了鱼藤酮 (rot) 和抗霉素 A (AA)。在通过添加叠氮化钠 (叠氮化物) 终止线粒体呼吸之前，抗坏血酸/TMPD (A/T) 刺激了复合物IV活性。

参考文献：Rhein V, et al. Amyloid-beta and tau synergistically impair the oxidative phosphorylation system in triple transgenic Alzheimer's disease mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Nov 24;106(47)

案例1.2：《完整细胞的代谢表征揭示了细胞内的β淀粉样蛋白减少线粒体呼吸》

关键词：细胞、呼吸能力、复合体IV

摘要：阿尔茨海默病的一个标志是由淀粉样蛋白 β (Aβ) 组成的老年斑，它源自淀粉样前体蛋白 (APP) 的加工过程。线粒体功能障碍与阿尔茨海默病的发病机制有关，据报道Aβ和APP都会影响孤立系统中的线粒体功能。然而，在完整细胞中，考虑到APP和Aβ的生理定位，需要深入挖掘触发线粒体缺陷的因素。作者分别进行了APP或β淀粉样前体蛋白裂解酶 1 (BACE1) 的过表达，并且进行多方面的代谢表征，作者证明只有APP过表达会降低线粒体呼吸，并且通过γ分泌酶inhibitor处理，会降低Aβ介导的线粒体毒性，恢复线粒体功能。因此，作者的数据为细胞内Aβ积累在阿尔茨海默病相关线粒体功能障碍中的重要作用提供了显著证据。

结果：O2k测量显示APP过表达后线粒体呼吸减少，但BACE过表达没有。在O2k中进行的高分辨率呼吸测量。蓝色曲线显示密封室中的氧气浓度，红色曲线显示细胞的耗氧量。滴定方案：在其条件培养基中添加 200万个细胞（常规呼吸）、1.25μM 寡霉素（泄漏呼吸）、将FCCP滴定至终浓度~3μM（ETS容量）、0.5μM 鱼藤酮和5μM 抗霉素A（残余氧消耗）。γ分泌酶inhibitor治疗可恢复HEK APP pUltra中的线粒体呼吸。星号表示HEK APP pUltra 与用相同浓度 GSI 处理的各个对照细胞的显著呼吸差异。

参考文献：Schaefer PM, et al. Metabolic Characterization of Intact Cells Reveals Intracellular Amyloid Beta but Not Its Precursor Protein to Reduce Mitochondrial Respiration. PLoS One. 2016 Dec 22;11(12):e0168157. 

案例二：O2k在帕金森病(PD)分子机制研究中的应用

引言：帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是除阿尔茨海默症（AD）外常见的神经退行性疾病，据2019年的全球估计显示，850多万人患有帕金森病。行走障碍是帕金森病患者常见的症状之一——走路不稳、容易摔倒，更严重者想走却走不了，脚好像被粘在地上，迈不开腿，被称为冻结步态。PD的主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的渐进性丢失和纹状体内多巴胺水平的降低。线粒体功能障碍可能是PD的发病机制。

案例2.1：《PERK过表达增强线粒体功能restrainPINK1B9苍蝇的神经退行性表型》

关键词：胸部肌肉组织、复合体I、复合体II

摘要：PTEN 诱导的假定激酶 1 (PINK1) 突变诱导常染色体隐性遗传帕金森病 (PD)，线粒体功能障碍是致病过程。越来越多的研究表明，线粒体功能障碍对神经元的大部分损伤源于内质网 (ER) 应激。在线粒体受损的 PINK1B9 苍蝇模型中，ER 应激的蛋白激酶 RNA 样 ER 激酶 (PERK) 如何发挥作用仍然是个谜。因此，作者生成了 PERK 过表达 (PEK OE) 和下调 (PEK RNAi) PINK1B9苍蝇并用进行了深入的分子机制研究。

结果：为了检测PEK OE对PINK1B9苍蝇线粒体功能恢复的影响，使用O2k评估线粒体功能变化。复合体I（CI）活性表示为通过输入Mg2+和 ATP进入O2K系统的氧通量，并且进一步测试了复合体II的活性。结果表明，PERK的过表达可以挽救 PINK1 PD 苍蝇的致病表型，它与线粒体功能的改善有关，主要是复合体I的功能活性增加。

参考文献：Cui Y et al. Overexpressed PERK suppresses the neurodegenerative phenotypes in PINK1B9 flies by enhancing mitochondrial function. Neurochem Int 140:104825 (2020).

案例2.2：《O2k揭示了帕金森病细胞模型中的MPP+线粒体毒性机制》

关键词：细胞、复合体Ⅰ

摘要：MPTP是一种结构类似于除草剂百草枯的分子，是一种可在人类中诱发严重帕金森综合征的神经毒物，会在帕金森病模型中损伤黑质纹状体系统的多巴胺能神经元。MPP+是MPTP的活性代谢物，在细胞内，MPP+发挥其在线粒体中聚集的毒性，阻断线粒体电子传递系统 (ETS) 的 复合体I的活性，导致 ATP 耗竭、活性氧 (ROS) 产生和神经元损伤/死亡。到目前为止，MPP+被认为是一种在各种细胞系中模拟多巴胺能变性的有价值的工具。但也有报告表明MPP+诱导的神经元死亡与复合物 I restrain无关，尽管已经进行了大量研究，但目前仍缺乏MPP+处理后神经元细胞线粒体呼吸的详细表征。

结果：通过O2k使用特定的底物-解偶联剂-inhibitor滴定 (SUIT) 方案检测暴露于神经毒素的分化神经母细胞瘤细胞中各种呼吸状态相关的耗氧量，并分析了特定线粒体复合体对呼吸能力的贡献。与CTRL对比表明，MPP+处理细胞后，呼吸状态 ROUTINE、OXPHOS、ETS均显著降低；并且用O2k评估了复合体II的功能活性，与CTRL对比表明，MPP+处理细胞后，琥珀酸依赖的复合体II的功能活性没有显著变化；说明OXPHOS显著降低主要是由复合体I的功能活性受restrain造成的。这些研究结果提供了关于 MPP+介导线粒体毒性的机制见解，利用O2k评估对线粒体中各个呼吸状态的耗氧量及特定复合体的呼吸能力，可以用于这种MPP+神经毒素进行帕金森病细胞疾病模型研究的标准化评估。

参考文献：Risiglione, et al. High-resolution respirometry reveals mpp+ mitochondrial toxicity mechanism in a cellular model of parkinson’s disease. In: International Journal of Molecular Sciences. 2020 ; Vol. 21, No. 21. pp. 1-15.

案例三：O2k在亨廷顿病(HD)分子机制研究中的应用

引言：亨廷顿病（Huntington's disease，HD），又称亨廷顿舞蹈症，是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病。HD患者通常在30到40岁之间发病，主要表现为不自主舞蹈样动作、认知障碍和精神异常。越来越多的证据表明亨廷顿舞蹈病患者神经元死亡的重要原因与线粒体功能障碍密切相关。

案例3.1：《亨廷顿病线粒体呼吸代谢组织特异性研究》

关键词：人体活检肌肉样本、小鼠、大脑皮层、肝脏、心肌、比目鱼肌、组织匀浆、复合体II

摘要：亨廷顿病(HD)是一种常染色体单基因显性遗传性神经退行性疾病，引起疾病发生的亨廷顿基因的突变同时也有可能引起骨骼肌线粒体呼吸代谢缺陷。转基因动物模型提供了相互交叉验证并允许跨器官（包括大脑）进行比较的机会。通过O2k比较从HD 敲入小鼠 (HdhQ111) 中分离的骨骼肌以及大脑皮层、肝脏和心肌的线粒体呼吸代谢，发现线粒体呼吸代谢发生显著变化仅限于肝脏和大脑皮层。

结果：O2k检测人类股外侧肌和小鼠大脑皮层和心肌线粒体能量代谢。大致实验方案是：添加丙酮酸、苹果酸 (M)、谷氨酸 (G) 和 ADP，检测复合体 I 活性 (CI) ，添加细胞色素 c 检查线粒体外膜完整性。添加琥珀酸盐，它是复合体II 底物，可以确定OXPHOS能力。添加ATP合酶inhibitor寡霉素 (O) ，加入FCCP，测量解偶联能力，加入复合体Iinhibitor鱼藤酮R，可以测量复合体 II 的活性 (CII)。数据统计分析：与对照相比，HdhQ111 小鼠肝脏的CII和解偶联能力显著降低，HdhQ111大脑皮层的解偶联能力和ATP耗氧能力显著升高。

参考文献：Buck E, et al. High-resolution respirometry of fine-needle muscle biopsies in pre-manifest Huntington’s disease expansion mutation carriers shows normal mitochondrial respiratory function. Plos One. 2017 Apr 13;12(4):e0175248.

案例四：O2k在肌萎缩侧索硬化症 (ALS)分子机制研究中的应用

引言：肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种由大脑和脊髓中上、下运动神经元退行性病变所引起的致命的神经退行性疾病。该病导致四肢、躯干、胸部、腹部肌肉逐渐无力并萎缩，从而影响运动、交流、吞咽和呼吸功能，然后致死。此病多于30～50岁发病，以上肢周围性瘫痪，下肢瘫痪，上下运动神经元混合性、对称性损害为特点。肌萎缩侧索硬化发病机制尚不完全清楚，可能的发病机制包括氧化应激、线粒体功能障碍等。

案例4.1：《脂肪源干细胞外泌体在ALS体外模型中恢复线粒体功能》

关键词：线粒体、复合体I、复合体II

摘要：肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 是一种致命的神经退行性疾病，其特征是运动神经元死亡，已确定超氧化物歧化酶 1 (SOD1) 蛋白的突变与该疾病有关，线粒体功能障碍是导致 ALS 中运动神经元选择性死亡的主要特征之一。NSC-34 细胞系，过表达人类 SOD1(G93A) 突变蛋白 [NSC-34(G93A)]，被认为是研究 ALS 的体外模型。作者通过O2k研究了 NSC-34(G93A) 细胞中的线粒体呼吸代谢，证明了 NSC-34(G93A) 细胞的线粒体氧化能力降低，并且表明脂肪干细胞外泌体能够恢复线粒体功能。

结果：O2k实验相关底物、inhibitor：添加丙酮酸和苹果酸 (PM) 和内源性底物维持常规呼吸；用洋地黄皂苷（Dig）渗透后评估泄漏呼吸；添加 ADP 刺激复合体 I（PMG）和复合体 II（PMGS）维持OXHPOS 能力；非耦合 ETS 容量（添加 CCCP）；数据统计分析：在 G93ADOXY+细胞中，与 G93ADOXY-相比，G93ADOXY+细胞中复合体 I (PMG) 维持的 OXPHOS 能力降低，其中主要是复合体 I 功能受到影响。另外评估外泌体在 NSC-34（G93A）细胞上的功效，ASCs-外泌体能够恢复复合体 I 的偶联效率和OXPHOS能力。

参考文献：Calabria E, et al. (2019) ASCs-Exosomes Recover Coupling Efficiency and Mitochondrial Membrane Potential in an in vitro Model of ALS. Front. Neurosci. 13:1070.

案例五：O2k在自闭症谱系障碍(ASD)分子机制研究中的应用

引言：自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，简称ASD），亦称孤独症谱系障碍，被定义为一组起源于儿童早期，以社会交往和沟通障碍、兴趣范围狭窄及重复刻板行为为主要特征的发育障碍。也经常被认为是一类以不同程度的社会交往和交流障碍、狭隘兴趣、重复刻板行为，以及感知觉异常为主要特征的神经发育障碍。越来越多的研究表明线粒体功能障碍与ASD之间存在联系，但相关的生物学基础还尚不清楚。

案例5.1：《线粒体失调与特发性自闭症谱系障碍 (ASD) 之间的联系：线粒体呼吸能力和膜电位的改变》

关键词：细胞、复合体IV、膜电位

摘要：自闭症谱系障碍（ASD）是一种由多种因素通过复杂机制引发的神经系统疾病。ASD的潜在病因机制已经进行了研究，但尚未确认单一原因。氧化应激的参与与 ASD 相关，并可能影响线粒体功能。本研究旨在通过关注线粒体呼吸能力和膜电位来阐明线粒体失调与特发性 ASD 之间的联系。

结果：分析了源自自闭症儿童 (ALCL) 的淋巴母细胞系 (LCL)的氧化磷酸化 (OXPHOS)、复合体 I 和复合体 II 连接途径的电子转移、膜电位和复合体 IV 活性的呼吸能力，并与来自发育正常的非自闭症同胞 (NALCL) 的对照细胞系进行了比较。所有实验均使用O2k进行。与健康对照组相比，ALCL OXPHOS的呼吸能力、复合体 I 和复合体 II 连接通路的电子转移以及复合体 IV 活性显著提高。线粒体膜电位也显著升高。这些结果表明线粒体功能障碍和自闭症相关联，对于更好地了解 ASD 发病机制以产生有效的干预措施非常重要。

参考文献：Hassan H, et al. A Link between Mitochondrial Dysregulation and Idiopathic Autism Spectrum Disorder (ASD): Alterations in Mitochondrial Respiratory Capacity and Membrane Potential. Curr Issues Mol Biol. 2021 Dec 16;43(3):2238-2252.

案例5.2：《Aralar 将 GABA 隔离到过度活跃的线粒体中，导致社会行为缺陷》

关键词：果蝇大脑、线粒体、组织匀浆

摘要：大量证据表明社交障碍与线粒体功能障碍和神经传递改变有关。尽管线粒体功能对脑内稳态至关重要，但线粒体受损是否会导致社会行为缺陷仍不清楚。另有研究发现CYFIP1（Cytoplasmic FMR1-interacting protein 1）与自闭症谱系障碍（ASD）相关，然而，将CYFIP1与行为和认知相关联的分子机制仍不清楚。作者发现了人CYFIP1同源基因中的果蝇突变体引起线粒体过度激活和果蝇社会行为的改变，确定了线粒体活性对γ-氨基丁酸（GABA）有效性的调节是可能的分子机制。此外，作者还发现Aralar是线粒体膜ji化激活GABA进入线粒体的转运体。这项研究加深了科学界对线粒体在生理病理条件下如何调节神经元稳态和社会行为的见解。另外研究表明，可以通过药理restrain线粒体呼吸作用，调节Aralar活性，来缓解果蝇模型中的社交障碍，以特异性激活或restrainAralar分子为焦点可能成为治疗这类疾病的潜在方法。

结果：作者使用O2k评估了突变果蝇是否表现出线粒体呼吸能力的改变。数据显示Cyfip85.1/+ 果蝇突变体大脑通过呼吸链的线粒体呼吸能力显着增加：包括复合体 I 和 II 的耦合呼吸水平和电子转移 (ET) 水平。线粒体呼吸的改变促使作者进一步检测了TCA循环，结果发现Cyfip85.1/+果蝇脑内TCA循环周期增加、呼吸链复合物I（CI）活性增加、代谢周期发生改变。作者通过restrainTCA周期和线粒体CI恢复了Cyfip85.1/+果蝇的社交障碍，表明社会行为与TCA循环存在关联，其中，TCA循环中的异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase，IDH）可能成为潜在治疗靶点。

参考文献：Kanellopoulos AK, et al. Aralar Sequesters GABA into Hyperactive Mitochondria, Causing Social Behavior Deficits. Cell. 2020;180(6):11781197.e20. doi:10.1016/j.cell.2020.02.044

案例六：O2k在海马体神经元分子机制研究中的应用

引言：海马体（Hippocampus），位于大脑丘脑和内侧颞叶之间，属于大脑的边缘系统，在学习、记忆、情绪反应及神经系统疾病的病理生理变化等方面有重要作用。海马体神经元细胞是海马体的主要细胞组成，主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节，是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一。海马组织是神经系统内主要的神经干细胞聚集区，具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布的特点，境界相对清晰，便于取材；海马神经元细胞是研究神经细胞生物学特性的有效细胞模型。

案例6.1：《促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 通过激活海马神经元中的 NF-kB-DRP1 轴来改变线粒体的形态和功能》

关键词：原代海马神经元细胞、OXPHOS、ETS、复合体IV

摘要：神经元应激适应结合了多种分子反应，胸部创伤会导致海马兴奋性突触的短暂丧失，这是由压力相关激素促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 的局部释放介导的。由于生理突触活动也依赖于线粒体功能，作者研究了线粒体直接参与由神经元 CRH 受体 1 (CRHR1) 激活诱导的适应性变化。作者发现线粒体发生形态变化，如线粒体肿胀和异常嵴增加，同时线粒体活性显著降低。研究结果表明，应激诱导的 CRHR1 激活导致线粒体动力学和形态发生强烈但可逆的改变。这些改变伴随着生物能量缺陷和神经元活动的减少，这与细胞内氧化应激增加有关。

结果：使用O2k研究海马神经元细胞在CRH处理后观察到的线粒体形态学变化（线粒体肿胀增加和异常嵴增加 ）是否与线粒体生物能量缺陷相关。海马神经元的OXPHOS、ETS和复合体 IV 的活性显著降低。与CRH和CRHR1拮抗剂NBI 共同处理初级神经元恢复了线粒体呼吸链的活性，同时线粒体形态没有发生变化。

参考文献：Battaglia CR, et al. Corticotropin-releasing hormone (CRH) alters mitochondrial morphology and function by activating the NF-kB-DRP1 axis in hippocampal neurons. Cell Death & Disease. 2020 Nov;11(11):1004.

案例七：O2k在线粒体菱形蛋白酶在神经系统作用机制研究中的应用

引言：膜内蛋白水解酶虽然曾经是一个有争议的概念，但却是一个广泛研究的领域。已经鉴定了四类膜内蛋白酶，并根据它们的肽键水解催化机制进行分类：金属蛋白酶、谷氨酰蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。这些类别中研究的一类是丝氨酸膜内蛋白酶的菱形超家族。在所有目前鉴定的菱形蛋白酶中，一种非常令人感兴趣的是哺乳动物线粒体菱形蛋白酶PARL（presenilin-associated rhomboid-like protein），其在维持神经系统稳态中的调节、活性和作用仍然需要很深入的探索。

案例7.1：《小鼠 PARL 缺乏会导致氧化磷酸化功能障碍和 Leigh 样综合征》

关键词：脑部、线粒体、突触体、复合体I、复合体II、复合体IV、ROS、Ca2+、膜电位

摘要：作者表明小鼠PARL敲除（Parl-/-）会导致类似于Leigh综合征的亚急性坏死性脑脊髓病,这是一种以能量产生中断为特征的线粒体脑肌病。Parl-/-脑线粒体受到进行性超微结构变化、氧化磷酸化功能障碍和线粒体钙代谢缺陷的影响。PARL在维持神经系统呼吸链中发挥着以前被忽视的组成性作用，其缺乏会导致进行性线粒体功能障碍和结构异常，从而导致神经元坏死和Leigh样综合征。

结果：电镜扫描了PARL 缺乏的线粒体超微结构，显示线粒体肿胀，嵴异常及消融；通过O2K耗氧率参数检测发现Parl-/-缺陷型脑线粒体氧化磷酸化和线粒体电子传递链受到很大的损伤，通过检测ROS，发现在复合体I有轻微的氧化应激，并且这种损伤通过检测Ca2+也发现线粒体对钙的吸收能力受到严重影响；又通过MMP（膜电位）参数检测发现在没有添加ADP的时候，MMP并没有显著差异，说明引起钙的吸收能力的影响因素很多，不一定是线粒体去ji化；添加ADP进行氧化磷酸化时，MMP有显著差异，说明线粒体整体功能确实受到了很大的影响。作者通过O2k多参数检测，从多个维度探索了线粒体在耗氧、ROS、MMP、Ca2+方面的差异，也反应这种线粒体内膜蛋白酶对维持线粒体氧化磷酸化、能量代谢等功能的稳态起到非常重要的作用。

参考文献：Spinazzi M, Radaelli E, et al. PARL deficiency in mouse causes Complex III defects, coenzyme Q depletion, and Leigh-like syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 2019 Jan 2;116(1):277-286.