案例一：癌蛋白新分子机制研究

关键词：癌蛋白、复合体I、ROS

引言：肿瘤生物学中基础的挑战之一是了解正常细胞如何变成恶性癌细胞。几十年前，科学家就发现癌蛋白可以调节细胞增殖、生长、死亡、分化和代谢的信号通路。如今，癌蛋白对癌症形成和发展的许多步骤有重要作用。癌蛋白的表达存在于许多正常组织中，没有任何表型，但也是某些先天性疾病和癌症的驱动因素。因此，需要对癌蛋白的多功能性进行更多方面的研究。

摘要：越来越多的证据表明，MDM2 癌蛋白在其对 p53 肿瘤restrain因子的典型负反馈调控机制之外促进肿瘤发生，但这些不依赖 p53 的功能仍然知之甚少。在这里，线粒体 MDM2 在体外和体内restrain NADH-脱氢酶 6 (MT-ND6) 的转录，影响线粒体复合体 I 的活性并增强线粒体 ROS 的产生。作者表明，在氧化应激和缺氧期间，MDM2 向线粒体的募集增加，以独立于 p53 控制线粒体呼吸和线粒体动力学。此外，增加的线粒体 MDM2 水平增强了癌细胞的迁移和侵袭特性。总的来说，这些数据揭示了线粒体中 MDM2 癌蛋白的一个以前未曾预料到的功能，并可能有助于肿瘤进展。

结果：作者用O2k评估分析了 MDM2 缺乏对耗氧量和线粒体复合体活性的影响。在谷氨酰胺、苹果酸和丙酮酸 (EIII GMP) 作为底物存在的情况下，与电子传递链 (ETC) 复合体 I (CI) 相关的状态 III 呼吸在MDM2 缺乏（sh MDM2）的H1299 细胞中显著增加，在与 CI inhibitor二甲双胍孵育后，MDM2 缺乏的 H1299 细胞耗氧量的增加被消除，进一步支持了 mtMDM2 restrainCI活性的作用；这些细胞在其线粒体超微结构中也表现出与对照组的形态学变化。

参考文献：Arena G, et al. Mitochondrial MDM2 Regulates Respiratory Complex I Activity Independently of p53. Mol Cell. 2018 Feb 15;69(4):594-609.e8. 

案例二：氧化代谢依赖在癌细胞生长的作用机制研究

关键词：乳腺癌、复合体I

引言：线粒体既是细胞的能量工厂，又参与调节细胞的氧化还原和稳态维持。与此相应，线粒体的代谢适能（metabolic fitness）或功能失衡（mitochondrial dysfunction）与机体和组织的健康或癌症的发生发展有着直接和密切的关联。其中，线粒体氧化磷酸化参与的氧化代谢及其调控是其功能态的核心环节。但线粒体氧化代谢如何在癌细胞生长中发挥作用的机制目前并没有被完全阐明，亟待进行更深入的研究。

摘要：作为Bcl-2家族中促进凋亡的主要基因之一BAD是乳腺癌患者良好临床结果的预后指标； 然而，BAD 是否会影响乳腺癌生物学尚不清楚。 在这里，作者发现 BAD 通过两种不同的机制增加了乳腺癌细胞的生长。机制一：S118 处 BAD 的磷酸化增加了 S99 的磷酸化、14-3-3 结合和 AKT 激活以促进癌细胞生长和存活。 另一个更突出的机制：BAD 以一种新的方式刺激线粒体耗氧量， 通过刺激复合体 I 的活性，促进了癌细胞生长的增强，并且对复合体 I 阻断后癌细胞发生凋亡。由此，作者提出线粒体氧化代谢依赖会促进癌细胞的生长。

结果：作者用O2k直接评估线粒体氧化代谢能力，并观察到 BAD 表达的细胞系（WT）常规呼吸Routine和呼吸能力ET显著增加，稳定表达 BAD 的拟磷酸 (S118D) 或非磷酸化 (S118A)的呼吸能力ET相对于Vector也显著增加，S118D相对于S118A的呼吸能力ET显著降低，并且O2k详细评估分析BAD 通过刺激复合体 CI 的活性来增加线粒体氧化代谢。将野生型和突变型 BAD 表达细胞注射到小鼠的皮下侧腹，并随时间测量肿瘤体积。 BAD-S118D 表达细胞形成的肿瘤，野生型 BAD 表达细胞形成中等大小的肿瘤，它们都明显大于来自 BAD-S118A 和载体对照细胞的肿瘤。

参考文献：Mann J, et al. Non-canonical BAD activity regulates breast cancer cell and tumor growth via 14-3-3 binding and mitochondrial metabolism. Oncogene. 2019 May;38(18):3325-3339. 

案例三：线粒体 DNA在癌细胞转移的作用机制研究

关键词：循环肿瘤细胞、肺转移瘤细胞、mtDNA、复合体II

引 言：  癌细胞转移是癌症致死的重要原因。转移过程分为多步，始于肿瘤细胞通过基底膜入侵周围血管或淋巴系统，终于在肿瘤位点的定植。为成功转移，肿瘤细胞适应不断变化的微环境。代谢可塑性赋予肿瘤在负面状态（如低氧、饥饿），特别是在增殖非依赖过程（如原发肿瘤的扩散）中存活的能力。线粒体赋予细胞快速适应环境变化的能力，但人体中肿瘤细胞如何快速调整线粒体的分子机制基本仍是未知。  

摘要：作者报告提到没有线粒体 DNA (mtDNA) 的肿瘤细胞显示出肿瘤生长延迟，并且肿瘤形成与从宿主细胞中获取 mtDNA 相关。这导致源自原发性肿瘤细胞的线粒体功能部分恢复，这些原发性肿瘤由没有 mtDNA 的细胞生长而成，并且肿瘤生长的延迟更短。来自循环肿瘤细胞的细胞系表现出线粒体呼吸的进一步恢复和肿瘤生长的中间滞后，而来自肺转移瘤的细胞表现出呼吸功能的完全恢复并且肿瘤生长没有滞后。研究结果表明，mtDNA 从肿瘤微环境中的宿主细胞水平转移到呼吸功能受损的肿瘤细胞，同时表明癌细胞具有高可塑性的概念。

结果：为了研究致瘤特性的获得是否与线粒体呼吸能力相关，通过O2k评估了由 4T1、4T1⍴0和衍生细胞系形成的肿瘤的线粒体呼吸能力。相对于来自亲本肿瘤的细胞，从4T1⍴0细胞生长的肿瘤的呼吸减少了百分之60，而 4T1⍴0SC、4T1⍴0CTC 和 4T1⍴0SCL 细胞衍生的肿瘤表现出线粒体呼吸能力的逐渐恢复，另外这些细胞的线粒体超微结构也表现出与4T1⍴0形态学上的逐渐恢复，并且发现4T1⍴0SCL线粒体功能的恢复与复合体II的功能活性的增强具有相关性。

参考文献：Tan AS, et al. Mitochondrial genome acquisition restores respiratory function and tumorigenic potential of cancer cells without mitochondrial DNA. Cell Metab. 2015 Jan 6;21(1):81-94.

案例四：肿瘤免疫机制研究

关键词：结直肠癌、共培养细胞

引言：过去的数十年中，肿瘤免疫治疗相关研究取得了重大突破，这进一步加深了科学家对调节免疫系统抗癌应答机制和通路的理解。其中肿瘤微环境中大量T细胞的浸润可预测免疫治疗的疗效。但T细胞发挥功能或功能障碍还需要细胞内信号和代谢途径之间的相互作用，其内在分子机制的研究对提高肿瘤免疫治疗疗效及开发新的药物治疗策略至关重要。

摘要：在结直肠癌患者中，肿瘤中高密度的细胞毒性CD8+ T细胞与更好的预后相关。作者揭示了肠道上皮细胞（IEC）中一个复杂的调控CD8+ T细胞诱导的分子机制，从而增强适应性免疫反应。IEC中线粒体自噬水平的升高导致上皮溶酶体（LMP）中铁的积累，进而触发溶酶体膜通透性。随后将蛋白酶释放到细胞质中通过树突状细胞增强了MHC I类抗原呈递和CD8+ T细胞的活化。作者的研究结果强调了线粒体功能、溶酶体完整性和IEC中MHC I类抗原呈递之间迄今为止未被认识到的联系，并表明在IEC中触发线粒体自噬或诱导溶酶体膜通透的疗法可能提高抗肿瘤结直肠癌的免疫治疗效果。

结果：作者通过O2k来评估分析离体共培养细胞的线粒体功能变化，与对照组结肠癌细胞系OVA-CMTscr相比，Stat3 缺陷的OVA-CMTStat3KD结肠癌细胞系的基础呼吸能力（basal OCR）和呼吸能力（maximal OCR）都显著增加，表明线粒体氧化磷酸化水平增强。文献中其它数据表明，增强的氧化磷酸化可能引发线粒体自噬，这将刺激抗原加工，从而进一步有助于改善肠道肿瘤restrain免疫功能。

参考文献：Ziegler et al. Mitophagy in Intestinal Epithelial Cells Triggers Adaptive Immunity during Tumorigenesis. Cell. 2018 Jun 28;174(1):88-101.e16. doi: 10.1016/j.cell.2018.05.028. 

案例五：肿瘤转化医学研究

关键词：前列腺癌组织、线粒体、复合体I

引言：近年来，转化医学在肿瘤领域的应用越来越广泛。肿瘤临床样本作为肿瘤基础与临床研究的关键源头，如何用好这些肿瘤临床样本进行肿瘤相关突变基因筛选、肿瘤的发生、发展和转移机制的探究等工作，是实现“肿瘤转化医学研究”的重要保证。

摘要：文献报道了良性/恶性人类前列腺组织临床样本中，线粒体呼吸、DNA变异和基因表达的情况。研究发现，前列腺癌（PCa）组织中NADH途径底物谷氨酸和苹果酸盐的呼吸能力降低，代谢显著向更高的琥珀酸盐氧化代谢转变，尤其是在前列腺癌中更为明显。编码线粒体复合体I（CI）基因的高水平有害变异与NADH途径氧化能力降低和琥珀酸盐氧化增强（复合体II途径）补偿相关。这些结果表明琥珀酸盐作为“前列腺癌代谢物”的重要性。鉴于这些发现，琥珀酸盐和复合体II（CII）是新型有希望的抗前列腺癌的药物靶点。

结果：从50例前列腺癌根治术标本中每例提取成对良性/恶性组织穿刺针活检。O2k评估每个前列腺标本的成对良性/恶性组织活检的OXPHOS水平，并且用H2O2进行短期处理以模拟氧化应激。与PCa组织相比，良性组织显示出显着更高的NADH通路OXPHOS容量（电子通过CI进入Q），在进一步添加琥珀酸盐 (S) 后，没有观察到OXPHOS (NSP) 和ET (NSE) 呼吸能力的差异，表明通过琥珀酸盐途径的会将电子转移增加来补偿NADH途径缺陷（电子通过CII进入Q）。与相应的良性样本相比，含线粒体DNA突变的前列腺癌恶性组织样本显示非常低的NADH通路容量（P&G&M；丙酮酸&谷氨酸&苹果酸），其 NADH通路容量降低了>百分之70，对这些突变的结构分析显示，氨基酸的变异导致了对复合体I的潜在有害影响，并证明了存在因果关系。

参考文献：Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun 11, 1487 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-15237-5.

案例六：肿瘤诊断标志物研究

关键词：黑色素瘤、细胞

引言：生物标志物（Biomarker）是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”，在肿瘤学领域，肿瘤标志物也一直是近年来的研究热点，肿瘤标志物能提供有用的信息帮助区分良、恶性肿瘤，在肿瘤预防、诊断和预后中发挥重要作用。作为个体化医疗的“关键词”之一，其相关研究方兴未艾。

摘要：为了评估特异性长链非编码RNA（lncRNA）基因在皮肤癌发展中的重要性，作者进行了大规模筛查，以研究众多lncRNAs在不同癌症类型之间的表达，并且筛查识别到SAMMSON作为一种黑色素瘤特异性lncRNA。研究表明，长链非编码RNA基因SAMMSON会在人类黑色素瘤中特异性地表达，并在大约百分之10的病例中复制或扩增。此外，在正常的黑色素细胞和其他任何正常的成体组织中都没有发现SAMMSON。另外作者发现，SAMMSON被召集到为癌细胞提供能量的线粒体，当通过靶向反义分子阻断SAMMSON时，能够中断至关重要的线粒体活性，阻止肿瘤生长。由于SAMSSON基因不在良性黑色素瘤中表达，SAMMSON可以作为恶性黑色素瘤的生物标记物，未来可以据此开发新的诊断方法以提高黑色素瘤的诊断准确度。

结果：通过O2k评估用GapmeR3（敲除 SAMMSON）处理的黑色素瘤细胞系SK-MEL-28中氧化磷酸化（OXPHOS）各复合体功能活性变化。与对照组（Ctrl）相比，GapmeR3呼吸率（解偶联剂CCCP处理）显著降低、复合体IV（Ascorbate和TMPD处理）功能活性显著降低；同时GapmeR3线粒体超微结构也表现出结构异常，具有较少和碎片化的嵴，而且降低了线粒体基质密度；另外GapmeR3黑色素瘤培养物的克隆形成数量也显著降低；这些数据表明黑色素瘤细胞对SAMMSON表达存在强烈依赖，当SAMMSON存在缺陷或含量下降，引起线粒体活性降低，促进细胞发生调亡，restrain黑色素瘤细胞生长。

参考文献：Leucci, E., et al. Melanoma addiction to the long non-coding RNA SAMMSON. Nature 531, 518–522 (2016). 

案例七：抗肿瘤药物研究

关键词：口腔鳞状细胞癌、天然产物药物、复合体IV

引言：恶性肿瘤是危害人们生命健康的重大疾病，抗肿瘤药物的研发任重而道远。化学合成的抗肿瘤药物在临床上虽然占据主要地位，但是随着人们越来越深刻地认识到它的毒副作用，从天然产物中寻找抗癌有效成分，已成为越来越多抗肿瘤药物相关工作者关注的。

摘要：Isoplumbagin (5-hydroxy-3-methyl-1,4-naphthoquinone)，一种天然存在的醌，具有抗炎和抗菌活性。长期以来，炎症一直与癌症进展相关。在这项研究中，作者研究了Isoplumbagin的抗癌作用机制。体内研究结果表明2 mg/kg Isoplumbagin对源自OSCC细胞的原位异种移植肿瘤(口腔颊)的生长有restrain作用。从机制上讲，Isoplumbagin通过降低癌细胞线粒体复合体IV活性，促进癌细胞发生凋亡，从而发挥其细胞毒性作用，起到抗癌的治疗效果。

结果：作者直接通过O2k进行检测研究了Isoplumbagin如何减少癌细胞线粒体 OXPHOS。Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，以谷氨酸/苹果酸为底物的复合体I功能活性和以琥珀酸为底物的复合体II功能活性没有变化，但以四甲基对苯二胺（TMPD）/抗坏血酸为底物的癌细胞复合体IV的功能活性明显降低。综上所述，这些数据表明Isoplumbagin可通过restrain癌细胞线粒体复合体IV活性减少OXPHOS水平。值得注意的是，作者也尝试用另外一组药物处理方案，如图所示，分别添加Oligomycin、FCCP、Rotenone & Antimycin，做胞外呼吸能力测试，Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，整体胞外呼吸能力有降低，但无法对癌细胞复合体IV功能活性是否存在显著性差异进行表征分析，无法进行更深入的机制研究。

参考文献：Tsao YC, et al. Discovery of Isoplumbagin as a Novel NQO1 Substrate and Anti-Cancer Quinone. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4378. Published 2020 Jun 19. doi:10.3390/ijms21124378.

案例八：肿瘤治疗药物耐药性研究

关键词：肾细胞癌、复合体I、复合体II

引言：肿瘤耐药性是限制目前癌症药物疗效的一大难题。癌细胞为什么会产生耐药性？这一问题仍然存在很多挑战。从线粒体呼吸代谢的角度对肿瘤耐药机制的研究将有利于发现针对性的可能治疗策略，这不仅有助于在耐药发生后补救治疗，也能提前阻止耐药的发生。

摘要：舒尼替尼（sunitinib）是一种血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶inhibitor，是晚期透明细胞肾细胞癌（RCC）的标准一线治疗药物，但耐药性不可避免。在这里，作者使用 RCC 细胞系 ACHN 和 786-O 研究了导致耐药的机制。文献中提到，耐药细胞表现出细胞凋亡减少、细胞活力增加、活性氧产生增加和线粒体功能中断。此外，舒尼替尼长期用药治疗导致 Sirt5/异柠檬酸脱氢酶 2 (IDH2) 表达水平的上调。敲除 Sirt5/IDH2 会损害线粒体功能并部分减弱耐药性。研究结果表明，Sirt5/IDH2 的失调通过影响抗氧化能力部分地促成了肾细胞癌细胞对舒尼替尼的耐药性。

结果：作者通过O2k分析了线粒体代谢状态，以更好地说明耐舒尼替尼细胞系（Sun-R）的耐药机制。 O2k结果表明，相对于Cont对照组细胞，Sun-R 细胞具有增加的复合体 I 依赖性氧化磷酸化 (CI OXPHOS)、氧化磷酸化 (CI+II OXPHOS) 和非耦合状态复合体 I+II 支持的非耦合呼吸 (CI+II ETS) 值。另外作者通过O2k也分析了sirt5 敲低对线粒体呼吸功能的影响。与 siNC 相比，siSirt5 显著降低了RCC 细胞系 ACHN 和 786-O中的复合体 I OXPHOS、复合体 I+II OXPHOS 和复合体 I+II ETS。

参考文献：Meng L, et al. Dysregulation of the Sirt5/IDH2 axis contributes to sunitinib resistance in human renal cancer cells. FEBS Open Bio. 2021 Mar;11(3):921-931. doi: 10.1002/2211-5463.13090.