案例一：

高分辨率光呼吸法研究光合作用和光增强暗呼吸的氧依赖性

关键词：PB-Module模块、光合作用、光增强暗呼吸

样本：藻类

参考文献：Went N,Di Marcello M,Gnaiger E(2021) Oxygen dependence of photosynthesis and light-enhanced dark respiration studied by High-Resolution PhotoRespirometry. MitoFit Preprints 2021.5.

Oroboros O2k的 PB-Module模块集成了具有严格可调光强的红光、蓝光以及全波长的白光。 PB-Module模块能够在受控的O2浓度下评估O2的净光合速率和光增强暗呼吸。 通过配置PB-Module模块，利用Oroboros O2k的高分辨率光呼吸法检测绿藻莱茵衣藻在不同氧浓度下的暗呼吸（Dark Respiration, DR）和净光合作用（Net Photosynthesis,NP）以及在明暗转换后测量光增强暗呼吸（Light-enhanced dark respiration, LEDR）。

结果：图中是两个O2k样品舱数据曲线的叠加。通过逐步增加光强度（蓝光，10到350μmol∙s-1∙m-2）将净O2产生速率（净光合作用NP）从常氧下的暗呼吸DR刺激到最大值。

光照增强暗呼吸 LEDR 是关闭灯后立即出现的呼吸尖峰。

通过间歇性打开舱室（箭头，air）来防止O2浓度达到严重的高氧状态。

从图中可以得出以下结论：

净光合作用的光抑制依赖于氧；

光增强暗呼吸不依赖氧；

光呼吸的影响小于依赖氧的光抑制。

案例二：

植物激素信号传导调控线粒体蛋白质稳态

关键词：暗呼吸检测

样本：拟南芥-叶片、线粒体

参考文献：Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress. 2017 Nov 2;68(3):540-551.e5.

方法：使用Oroboros O2k在24℃黑暗中测量叶片暗呼吸。

首先将来自拟南芥植物的叶盘悬浮在叶片呼吸缓冲液中，在黑暗中孵育30分钟，然后记录耗氧率。根据叶盘的鲜重归一化计算耗氧率。

使用Oroboros O2k在24℃在黑暗中对拟南芥植物叶片中分离的线粒体进行暗呼吸测定。在测量过程中，将线粒体蛋白悬浮在反应混合物中分别加入丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、ADP和没食子酸正丙酯测量复合物I呼吸能力，然后加入琥珀酸盐测量总呼吸能力。

结果：

(A) mrpl1-1, mrpl1-3 (mitochondrial ribosomal protein L1, MRPL1) 是拟南介线粒体核糖体蛋白 L1突变体，与野生型相比，突变体叶片整体OCR显著降低；

(B)Dox是一种抑制线粒体蛋白翻译的强力霉素，野生型经Dox处理后，其线粒体整体OCR显著降低，复合物I呼吸能力也显著降低；

(C)ACC(乙烯前体)是由ACC合酶合成的非蛋白氨基酸，ACC经常被用来诱导乙烯响应，而乙烯抑制根的生长；Ag2+是乙烯作用抑制剂，分别用ACC和Ag2+处理野生型，只有通过ACC处理后的线粒体整体OCR显著升高，复合物I呼吸能力也显著升高。

结论：拟南芥MRPL1 功能突变体实验（实验A）和Dox药物处理实验（实验Ｂ）引起线粒体翻译受损，降低复合物I呼吸能力和整体呼吸能力，乙烯能够通过其信号传导调控线粒体蛋白质稳态，提高复合物I呼吸能力和整体呼吸能力。

案例三：

拟南芥根部感染根肿菌引起的缺氧反应与根肿病的发生密切相关

关键词：呼吸作用

样本：拟南芥-全根长

参考文献：BMC Plant Biology | Hypoxia response in Arabidopsis roots infected by Plasmodiophora brassicae supports the development of clubroot. (2016) 16:251.

方法：使用Oroboros O2k在7 dpi （=14 days following germination）植物根样品中评估呼吸作用；O2k检测舱装满去离子水并通过空气鼓泡使氧气饱和。 在每个实验中，根据室温和大气压校准测量值。 将根样品浸入检测舱中，同时适当搅拌培养基，用水封舱，并立即（5 分钟）监测水中氧浓度的降低。 耗氧率除以根的新鲜生物量。缺氧相关基因标志物酒精脱氢酶 1 (ADH1) 在根肿菌eH感染后诱导表达，而且ADH1启动子驱动的 GUS 表达仅限于根的最深部分，所以GUS染色的情况可以反映植物根感染后对缺氧的响应程度；如下图，分别进行7 dpi 和 21 dpi 未接种的根样品（NI）以及接种了分离株 eH植物根的GUS染色，其中7 dpi eH 根并未发生根肿，GUS染色较浅；而21 dpi 发生明显根肿，而且GUS染色很深。

结果：7 dpi 根肿感染的呼吸能力并没有显著降低，缺氧响应不明显。

结论：在植物根肿病发生发展的过程中，根的缺氧适应性响应逐渐增强。

案例四：

影响拟南芥种子寿命和休眠的新参与者：AtFAHD1a ？

关键词：呼吸作用

样本：拟南芥-种子

参考文献：Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress

方法：使用Oroboros O2k对F2的干种子进行OCR表征。干种子直接吸入含有超纯水的检测舱里。种子OCR指示线粒体呼吸。此后，添加KCN（一种线粒体电子传递链(ETC) 的复合物IV（即细胞色素c氧化酶）抑制剂）通过抑制复合物 IV 来阻断呼吸。最后，注射没食子酸辛酯（一种线粒体替代氧化酶抑制剂），以评估这种KCN不敏感的线粒体ETC旁路对O2的消耗。在种子冻干5天后，基于干重对种子OCR数据进行归一化。

结果：(Figure A)在Atfahd1a-1种子中，O2消耗峰值的最大呼吸水平比在WT种子中高1.3倍，有显著性差异；(Figure B)添加 KCN后，复合物IV的活性在Atfahd1a-1种子中显着更高，有显著性差异。

结论：Atfahd1a-1种子在吸收开始后显示出比WT种子更快的OCR恢复。

案例五：

烟草中UCP1过表达介导线粒体生物发生并且放大了广泛的应激反应

关键词：呼吸作用

样本：烟草叶、线粒体

参考文献：BMC Plant Biology | Systems Overexpression of UCP1 in tobacco induces mitochondrial biogenesis and amplifies a broad stress response

方法：使用Oroboros O2k对WT和P07（转基因AtUCP1高表达）植物的粗分离线粒体进行线粒体呼吸的测量。首先进行粗分离线粒体，然后将含有粗线粒体的沉淀重悬于洗涤缓冲液中。苹果酸和谷氨酸被用作呼吸的底物。添加ADP以测量ADP依赖性呼吸。寡霉素用作ATP合酶抑制剂来测量由于解偶联活性引起的耗氧量，化学离子载体羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP)(2μM) 用于测定最大耗氧量。

结果：WT和P07植物烟草叶中分离的粗线粒体保留了它们的呼吸特性：与基础呼吸相比，ADP和FCCP可以有效地增加耗氧量。

结论：AtUCP1过表达增加解偶联呼吸能力

案例六：

短期高温处理会降低南洋杉细胞活力并抑制呼吸

关键词：呼吸作用

样本：悬浮培养的南洋杉胚胎细胞

参考文献：Physiologia Plantarum | Short-term high temperature treatment reduces viability and inhibits respiration and DNA repair enzymes in Araucaria angustifolia cells.

方法：将细胞重新悬浮在1 ml呼吸培养基中，并均质化处理。用Oroboros O2k测定细胞呼吸，培养基中添加了苹果酸和谷氨酸、FCCP、SHAM（水杨基肟酸，AOX交替氧化酶特异抑制剂）、抗霉素 A。

结果：如图所示，细胞经过热处理后立即在 28℃下测量细胞的呼吸作用，其中：a值与对照 25℃（生长条件）显著性差异；b值与30℃ 24 h显著性差异；c值与30℃ 48 h显著性差异；d值与37℃ 6 h显著性差异，e值与42℃ 2 h 显著性差异。无论预处理如何（除了42℃ 2 小时）。添加苹果酸和谷氨酸可强烈刺激呼吸，而添加FCCP几乎没有影响。SHAM 降低了大约30%的速率，并且抗霉素完全抑制了SHAM不敏感的氧化。唯一具有显著效果的预处理是42℃ 2 小时，这将所有呼吸频率降低了> 80%。

结论：高温胁迫会降低A.angustifolia细胞的活力并抑制呼吸。

案例七：

短期UV-B暴露会导致收获的柠檬果皮发生代谢变化

关键词：呼吸作用

样本：柠檬、果皮

参考文献：Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology | Short-term UV-B exposure induces metabolic and anatomical changes in peel of harvested lemons contributing in fruit protection against green mold

方法：用Oroboros O2k评估柠檬的耗氧量，将组织样本分成小块，并加入到含有缓冲液的检测舱中检测。氰化钾(KCN)用于抑制细胞色素氧化酶途径 (COX)，L-1水杨基异羟肟酸(SHAM)用于抑制替代氧化酶途径(AOX)。总耗氧量相当于COX加AOX加残余呼吸。

结果：如下图所示，在指定日期测量对照(C)和UVBR处理(T)的耗氧量。(A)总呼吸测量（细胞色素呼吸(白条)+交替呼吸(黑条)+残余呼吸(条纹条)的总和)；(B)细胞色素呼吸(白条)、交替呼吸(黑条)和残余呼吸(条纹条)。不同字母表示具有显著性差异。到第 7 天，来自C和T柠檬的细胞的总呼吸曲线相似(图A)，此后，C柠檬的总呼吸保持低水平，而T柠檬的呼吸增加直到第30天。

结论：成熟的采后柠檬短期暴露于UV-B会诱导对辐射的适应反应。