奥地利OROBOROS  O2k植物能量代谢解决方案

植物在生长发育过程中受外界环境(如光照、温度、生物和非生物胁迫等)影响会调整自身能量代谢,导致植物在整体生长和结构方面有很强的可塑性,所以深入探究植物能量代谢调控机制研究具有重要的生物学意义,将直接影响绿色植物的生长、发育等生命活动,并且可以应用于生产实践中作物产量的提高及农产品的贮存。

RESEARCH

SOLUTIONS OF

PLANT ENERGY

METABOLISM

案例一:

 

高分辨率光呼吸法研究光合作用和光增强暗呼吸的氧依赖性

PB-Module、光呼吸法、光合作用、光增强暗呼吸

样本:藻类

 

 

植物(包括大部分藻类)其体内含有两种与能量相关的细胞器,即叶绿体和线粒体;其中线粒体消耗糖类产生能量,而叶绿体在有光的条件下可将光能转化为糖类等有机物。

线粒体和叶绿体之间的生物能量串扰在维持代谢完整性和控制代谢物产生以促进生长方面发挥着关键作用。

 

OROBOROS  O2k的 PB-Module集成了具有严格可调光强的红光、蓝光以及全波长的白光。

PB-Module能够在受控的O2浓度下评估O2的净光合速率和光增强暗呼吸。通过配置PB-Module模块,利用Oroboros O2k的高分辨率光呼吸法检测绿藻莱茵衣藻在不同氧浓度下的暗呼吸(Dark Respiration, DR)和净光合作用(Net Photosynthesis,NP)以及在明暗转换后测量光增强暗呼吸(Light-enhanced dark respiration, LEDR)。

 

 

图中是两个O2k 样品室数据曲线的叠加。通过逐步增加光强度(蓝光,10到350μmol∙s-1∙m-2)将净O2产生速率(净光合作用NP)从常氧下的暗呼吸DR刺激到最大值。光照增强的暗呼吸 LEDR 是关闭灯后立即出现的呼吸尖峰。通过间歇性打开腔室(箭头,air)来防止O2浓度达到严重的高氧状态。

 

从图中可以得出以下结论:净光合作用的光抑制依赖于氧;光增强暗呼吸不依赖氧;光呼吸的影响小于依赖氧的光抑制。

案例二:

植物激素信号传导调控线粒体蛋白质稳态

暗呼吸检测

样本:拟南芥-叶片、线粒体

 

参考文献:Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress. 2017 Nov 2;68(3):540-551.e5.

 

方法:使用OROBOROS  O2k在24℃黑暗中测量叶片暗呼吸。

首先将来自拟南芥植物的叶盘悬浮在叶片呼吸缓冲液中,在黑暗中孵育30分钟,然后记录耗氧率。根据叶盘的鲜重归一化计算耗氧率。

从拟南芥植物叶片中分离的线粒体的暗呼吸测定也使用OROBOROS  O2k在24℃在黑暗中进行。在测量过程中,将线粒体蛋白悬浮在反应混合物中,在丙酮酸、谷氨酸、苹果酸、ADP和没食子酸正丙酯存在下测量复合物I呼吸能力,然后加入琥珀酸盐测量总呼吸能力。

 

结果:

(A)mrpl1-1, mrpl1-3 (mitochondrial ribosomal protein L1, MRPL1) 是拟南介线粒体核糖体蛋白 L1突变体,与野生型相比,突变体叶片整体OCR显著降低

(B):Dox是一种抑制线粒体蛋白翻译的强力霉素,野生型经Dox处理后,其线粒体整体OCR显著降低,复合物I呼吸能力也显著降低;

(C):ACC是乙烯前体,Ag2+是银离子,分别用ACC和Ag2+处理野生型,只有ACC处理后其线粒体整体OCR显著升高,复合物I呼吸能力也显著升高。

 

结论:拟南芥MRPL1 功能丧失或Dox药物干扰引起线粒体翻译受损,降低复合物I呼吸能力和整体呼吸能力,乙烯能够通过其信号传导调控线粒体蛋白质稳态,提高复合物I呼吸能力和整体呼吸能力。

 

 

案例三:

 

拟南芥根部感染根肿病菌(Plasmodiophora brasicae)引起的缺氧反应加剧根肿病的发生暗呼吸检测

呼吸作用

样本:拟南芥-全根长

 

参考文献:BMC Plant Biology | Hypoxia response in Arabidopsis roots infected by Plasmodiophora brassicae supports the development of clubroot. (2016) 16:251.

 

 

 

方法:使用OROBOROS  O2k在植物根样品中评估呼吸作用。

氧合仪检测腔装满去离子水并通入空气鼓泡使氧气饱和。

在每个实验中,根据室温和大气压校准测量值。将根样品浸入检测腔中,同时适当搅拌培养基,用水封腔,并立即(5分钟内)监测水中氧浓度的降低。耗氧率除以根的新鲜生物量。

如图:未接种的根样品 (NI),以及接种了分离株eH或e2的植物的根。

 

案例四:

 

AtFAHD1a:影响拟南芥种子寿命和休眠的新参与者?

呼吸作用

样本:拟南芥-种子

 

参考文献:Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress

 

 

方法:使用 OROBOROS  O2k对F2的干种子进行OCR表征。干种子直接吸入含有超纯水的检测腔里。种子OCR,指示线粒体呼吸。此后,添加KCN(一种线粒体电子传递链(ETC) 的复合物IV(即细胞色素c氧化酶)抑制剂)通过抑制复合物 IV 来阻断呼吸。最后,注射没食子酸辛酯(一种线粒体替代氧化酶抑制剂),以评估这种KCN不敏感的线粒体ETC旁路对O2的消耗。在种子冻干5天后,基于干重对种子OCR数据进行归一化。

 

结果:(Figure A)在Atfahd1a-1种子中,O2消耗峰值的最大呼吸水平比在WT种子中高1.3倍,有显著性差异;(Figure B)添加 KCN后,复合物IV的活性在Atfahd1a-1种子中显着更高,有显著性差异。

 

结论:Atfahd1a-1种子在吸收开始后显示出比WT种子更快的OCR恢复。

 

案例五:

 

烟草中UCP1过表达介导线粒体生物发生并且放大了广泛的应激反应

呼吸作用

样本:烟草叶、线粒体

 

参考文献:Molecular cell | Systems Phytohormone Responses to Mitochondrial Proteotoxic Stress

 

 

方法:使用 OROBOROS  O2k对WT和P07(转基因AtUCP1高表达)植物的粗分离线粒体进行线粒体呼吸的测量。首先按文献报道进行粗线粒体的分离,然后将含有粗线粒体的沉淀重悬于洗涤缓冲液中。苹果酸和谷氨酸被用作呼吸的底物。添加ADP以测量ADP依赖性呼吸。寡霉素用作ATP合酶抑制剂来测量由于解偶联活性引起的耗氧量,化学离子载体羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙 (FCCP)(2μM) 用于测定最大耗氧量。

 

结果:WT和P07植物烟草叶中分离的粗线粒体保留了它们的呼吸特性:与基础呼吸相比,ADP和FCCP可以有效地增加耗氧量。

 

结论:AtUCP1过表达增加解偶联呼吸能力

 

案例六:

 

 

AtFAHD1a:影响拟南芥种子寿命和休眠的新参与者?

呼吸作用

样本:拟南芥-种子

 

参考文献:Physiologia Plantarum | Short-term high temperature treatment reduces viability and inhibits respiration and DNA repair enzymes in Araucaria angustifolia cells.

 

方法:将细胞重新悬浮在1 ml呼吸培养基中,并在均质器中均质化。用 OROBOROS  O2k测定细胞呼吸,培养基中添加了苹果酸和谷氨酸、FCCP、SHAM(水杨基肟酸,AOX交替氧化酶特异抑制剂)、抗霉素 A。

 

结果:如图所示,细胞经过热处理后立即在 28℃下测量细胞的呼吸作用,其中:a值与对照 25℃(生长条件)显著性差异;b值与30℃ 24 h显著性差异;c值与30℃ 48 h显著性差异;d值与37℃ 6 h显著性差异,e值与42℃ 2 h 显著性差异。无论预处理如何(除了42℃ 2 小时)。 添加苹果酸和谷氨酸可强烈刺激呼吸,而添加FCCP几乎没有影响。SHAM 降低了大约30%的速率,并且抗霉素完全抑制了SHAM不敏感的氧化。具有显着效果的预处理是42℃ 2 小时,这将所有呼吸频率降低了 > 80%。

 

结论:高温胁迫会降低A.angustifolia细胞的活力并抑制呼吸。

案例七:

 

 

短期UV-B暴露会导致收获的柠檬果皮发生代谢变化

呼吸作用

样本:柠檬、果皮

 

参考文献:Journal of Photochemistry & Photobiology, B: Biology | Short-term UV-B exposure induces metabolic and anatomical changes in peel of harvested lemons contributing in fruit protection against green mold

 

 

方法: OROBOROS  O2k评估柠檬黄的耗氧量,将组织样本分成小块,并加入到含有缓冲液的检测腔中检测。氰化钾(KCN)用于抑制细胞色素氧化酶途径 (COX),L-1水杨基异羟肟酸(SHAM)用于抑制替代氧化酶途径(AOX)。总耗氧量相当于COX加AOX加残余呼吸。

 

结果:如下图所示,在指定日期测量对照(C)和UVBR处理(T)的耗氧量。(A)总呼吸测量;(B)细胞色素呼吸(白条)、交替呼吸(黑条)和残余呼吸(条纹条)。不同字母表示具有显著性差异。到第 7 天,来自C和T柠檬的细胞的总呼吸曲线相似(图A),此后,C柠檬的总呼吸保持低水平,而T柠檬的呼吸增加直到第30天。

 

结论:成熟的采后柠檬短期暴露于UV-B会诱导对辐射的适应反应。