液滴微流控助力丝状真菌：高通量遗传转化技术新突破

本研究的核心动因，是解决丝状真菌工业应用与基础研究中的两大核心行业痛点，同时填补液滴微流控技术在真菌领域的应用空白。

 

1.丝状真菌的工业价值与传统转化技术的致命瓶颈

丝状真菌（尤其是里氏木霉）是工业纤维素酶、重组真核蛋白、生物活性天然产物的核心生产底盘，其工业化应用高度依赖菌株的遗传改造。目前主流的原生质体介导转化法，存在四大无法突破的局限：

1)原生质体再生效率极低：传统双层琼脂平板法需7~14天才能完成再生，最终再生频率不足4%；

2)筛选通量严重不足：依赖营养缺陷型互补或抗生素抗性筛选，前者需提前构建缺陷型菌株，后者会抑制转化子生长，且无法实现大规模并行筛选；

3)技术适配性差：荧光激活细胞分选（FACS）仅能分选真菌孢子，无法处理细胞壁缺失、极度脆弱的原生质体；

4)成本居高不下：体系体积大，纤维素酶诱导的黄金底物槐糖价格昂贵，无法在传统体系中规模化使用。

2.液滴微流控技术的优势与应用困境

液滴微流控是微生物研究的颠覆性工具，具备单胞包埋、体积微型化、超高通量筛选的核心优势：可将单个细胞包裹在纳升级油包水液滴中独立培养，筛选速度较传统微孔板体系提升1000倍以上，试剂用量降低数百倍，已在细菌、酵母、藻类中得到广泛应用。

但该技术在丝状真菌研究中几乎完全受限，核心障碍是：丝状真菌的分支菌丝生长速度极快，会快速刺破液滴、导致液滴合并、堵塞微流控通道，无法完成稳定的培养与分选。

本研究的核心目标：开发一套基于液滴微流控的丝状真菌高通量遗传转化完整方案，同时解决原生质体再生效率低、筛选通量不足、液滴体系适配性差三大行业难题。

本研究以工业模式菌株里氏木（Trichodermareesei）为模型，首次建立了原生质体转化-液滴单胞包埋-诱导培养-高通量荧光分选-菌株回收的全流程高通量转化平台，核心突破性成果如下：

1)原生质体再生性能跨越式提升：液滴培养使里氏木霉原生质体再生时间从传统平板的7天缩短至24小时（提速7倍），3天再生频率达31.62%，是传统平板法（3.65%）的8倍以上；

2)超高通量筛选能力：平台筛选速度最高可达8000液滴/分钟，2小时内可完成超70万液滴的分选，通量较传统体系提升超1000倍；

3)转化子阳性率极高：分选后回收的转化子中，超96%的菌株成功整合了GFP标记基因，远高于传统筛选方法；

4)突破菌丝生长核心瓶颈：通过优化诱导条件（2%槐糖、24小时培养），在菌丝刺破液滴前完成标记基因表达与分选，彻底解决了液滴合并、通道堵塞的行业难题；

5)试剂成本大幅降低：1nL级液滴培养体系，使培养基用量降低11倍，荧光底物用量降低555倍，昂贵的槐糖诱导物可低成本规模化使用。

在24小时液滴培养期间，无论碳源种类如何，丝状真菌里氏木霉在油包水液滴中的菌丝均能生长（图a）。通过前向散射光（FSC）强度分析的液滴粒径分布显示，真菌生长过程中平均约98%的液滴保持稳定。然而，仅在槐糖诱导培养基中检测到GFP表达。因此，选择槐糖用于在油包水液滴培养中诱导里氏木霉PC‑CBHI‑GFP的早期GFP表达。

(图a)里氏木霉PC‑CBHI‑GFP及其亲本菌株里氏木霉PC‑3–7在不同碳源下的液滴培养。将单孢子包埋于液滴中，28 ℃孵育24 h后用荧光显微镜观察。(图b)里氏木霉PC‑CBHI‑GFP在含槐糖诱导培养基的液滴中孢子萌发、生长及GFP表达的显微照片。

1.核心实验结论

本研究首次成功建立了基于液滴微流控平台的丝状真菌高通量遗传转化完整工作流，实现了从原生质体转化、单胞包埋、诱导培养到阳性转化子分选回收的全流程打通，填补了行业技术空白。

1)该方法较传统原生质体转化方法实现了全方位性能跃升：原生质体再生时间缩短7倍，再生频率提升8倍，筛选通量提升超1000倍，转化子阳性率超96%，同时大幅降低了试剂成本与人工耗时。

2)研究突破了液滴微流控在丝状真菌中应用的核心瓶颈，通过优化诱导条件与培养窗口，解决了菌丝生长导致的液滴失效、通道堵塞问题，为液滴技术在真菌研究中的广泛应用奠定了基础。

 

2.行业应用价值

1)工业菌株育种：可大幅加快纤维素酶、重组蛋白、天然产物生产菌株的定向进化与工程改造，缩短育种周期，降低研发成本；

2)真菌基因功能研究：可实现真菌基因编辑菌株的高通量筛选，大幅加快真菌功能基因组学研究进程；

3)合成生物学应用：为丝状真菌合成生物学底盘细胞的构建与优化提供了高通量工具，拓展了丝状真菌在生物制造领域的应用边界。

本研究中假阳性主要来自真菌自发荧光，未来可通过优化荧光底物、开发细胞活力检测型筛选体系、优化分选阈值等方式进一步降低假阳性；同时该方法可拓展至其他丝状真菌物种，以及基于酶活、代谢产物的功能筛选场景。

 

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678422000620?via%3Dihub