实验小技巧 | 分离线粒体或透化的组织和细胞
摘要：虽然线粒体分离仍然是生物能量学和线粒体生理学研究的金标准之一，但透化组织或细胞已成为具有多种优势的替代方案。但是，为了优化实验设计和对结果进行严格评估，也有一定的注意事项。
1、透化组织或细胞与分离的线粒体（pti、pce与imt）
1.1. 一般注意事项
1. 呼吸量通常与分离线粒体（imt）中的线粒体蛋白量或透化组织（pti；包括渗透肌纤维pfe）中的组织量有关，而在活细胞和渗透细胞中，每个细胞的O2流量通常是归一化的。需要注意，对每个线粒体蛋白的呼吸通量变化的解释是不同的，每质量的组织是组织特异性，而不是线粒体特异性通量，每百万细胞呼吸通量随细胞大小变化，因此不能比较如血小板和成纤维细胞或心肌细胞。
2. 使用人体骨骼肌渗透性纤维（pfe）对进行的呼吸检测结果与imt的数据一致。
3. 将电子传递到呼吸系统的不同复合物、三羧酸循环的不同片段和转运体的特定底物，用于特定线粒体通路的功能评估。
4. 评估氧化磷酸化的最大能力需要底物组合，以重建生理三羧酸循环功能。
5. 很少有关于pfe的研究报道氧通量对不同底物浓度的依赖性，且pfe或pce和imt的直接比较也很少。
6. 因为敏感性不同，pce和pti的最佳解偶联剂浓度不能从imt的研究中推断出来。
1.2. 透化组织或细胞的优势 (pti、pce)
1. 与imt相比，pti需要更少的组织或更少的细胞。使用O2k，每次实验测试仅需1 mg 湿重的心脏纤维，或30万个细胞（成纤维细胞、内皮细胞），在37°C的2 ml舱室中。
2. 与优化pti相比，imt的优化可能会花费更多时间。
3. 所有类型的线粒体都可以在pti和pce中通过实验获得，即imt制备允许分离不同的线粒体。
1.3.分离线粒体 (imt) 的优势
1. imt的制备需要分离和研究不同的线粒体亚群。
2. imt的混悬液代表组织样本的平均值。
3.由于O2扩散到非灌注纤维束中的线粒体，渗透肌纤维呼吸的氧依赖性增加了两个数量级。因此，我们选择imt来进行线粒体氧动力学的研究（小的悬浮细胞也是一个很好的模型）。在对肌肉纤维的研究中，必须严格避免低氧水平。电解产生的O2和H2O2滴定到含有H2O2的MiR06中，增加了O2k舱室内的O2浓度。
4. ADP必须在高浓度下加入到pfi中，以达到最大的氧化磷酸化容量，因为扩散限制和线粒体外膜可能发挥不同于imt的屏障功能。
2、透化组织制备和呼吸测量
1. 机械组织分离的评价：机械组织分离必须使用适当锋利的镊子，其分离程度可以通过观察分离的纤维束的颜色的变化来评价（类似于肝组织），将培养皿放在深色背景上时，可更好的观察到这一点。常规实验的一个实际限制可能是10-20 mg湿重的组织，随后被分成2-5 mg的样本进行实验。
2. 细胞膜的机械和化学透性：机械组织制备导致细胞膜的部分（骨骼肌）或完全（心肌、肝组织）透化。这种方法可能无法获得完整的活细胞。部分透化的样品需额外的化学透化（皂苷或洋地黄苷），通过标准化的孵育条件使线粒体外膜和内膜保持完好无损。在仅仅是机械渗透的组织中，必须通过在氧化磷酸化状态下的呼吸中添加皂苷或洋地黄苷来检查样品是否完全透化。在这些条件下，完全透化的细胞预计不会有呼吸刺激。
3. 在每次实验中测量1-2 mg组织的耗氧量需要高分辨率的呼吸测量。仪器对O2k的检测极限为1pmolO2∙-1∙mL-1，直到空气饱和。
4. 按照标准程序，实验前组织样品的稳定性通常是足够的。通过将组织样品保存在细胞保存培养基中可延长其稳定性。因为一些细胞在组织取样期间被透化，可将透化后的样品储存时间最小化，或透化后保存在细胞保存培养基中以延长储存时间。
呼吸检测中样品制备的稳定性取决于高质量线粒体呼吸介质的应用。高稳定性允许应用复杂的和扩展的底物-解偶联抑制剂滴定（SUIT）方案。
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