引言
据世界卫生组织资料统计，全球每年癌症发病约1000万，死亡约700万，已成为仅次于心血管病的人类d二杀手。而近几年中国每年新增肿瘤病人200万人，死亡130多万人，目前全国肿瘤患者总数约为450万人左右。化学合成的抗肿瘤药物在临床上虽然占据主要地位，但是随着人们越来越深刻地认识到它的毒副作用，从天然产物中寻找抗癌有效成分，已成为越来越多药物相关工作者关注的要点。
天然产物药物研究为什么要关注线粒体？
线粒体是细胞生命活动的能量工厂，是几乎所有真核生物都存在的一种细胞器。它的主要功能是进行氧化磷酸化 (OXPHOS) 合成 ATP，是糖类、脂肪和氨基酸等物质的z终氧化释放能量的场所，对维持生物体正常生理功能至关重要；线粒体除了作为细胞内能量生成的关键细胞器，还参与细胞凋亡、自由基生产、脂质代谢等代谢过程，其功能障碍与癌症、糖尿病、高血压、肌肉减少症、肌肉萎缩症、心力衰竭、动脉粥样硬化、阿尔兹海默症、帕金森症、慢性肾病、巴氏综合症、亨廷顿舞蹈症等多种疾病的发生发展密切相关。因此，线粒体是这些疾病的一个重要药物靶点，也是天然产物药物研发的热点。
靶向线粒体氧化磷酸化为天然产物药物研发带来的机遇
线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）系统是线粒体能量代谢的中心，是真核细胞能量产生的关键。支持OXPHOS系统运转的是电子传递链（ETC）的上五种酶复合体：复合体I、复合体II、复合体III和复合体IV，由复合体I-IV生成的质子梯度随后被复合体V所利用，催化ADP磷酸化生成ATP。OXPHOS系统中任何一个复合体发生异常或功能障碍都与很多疾病的发生发展密切相关。
线粒体氧化磷酸化各复合体功能活性评估方法存在的困难
目前在抗癌药物研发过程中，线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）已成为耐药癌细胞的主要靶点，也是天然产物药物研发策略的新方向，但是靶向线粒体氧化磷酸化 药物研发 的方法在很大程度上还需要完善，如何快速评估分析OXPHOS各复合体的功能活性，是靶向线粒体氧化磷酸化药物研发的技术难点。目前对OXPHOS各复合体功能活性的评估，主要是采用比色法，操作时间长，步骤多，只能对单个复合体功能活性进行终点法的评估，无法一次性实时动态分析评估同一样本各个复合体的功能活性。
解 决 方 案：Oroboros O2k一次性同时快速检测氧化磷酸化各复合体功能活性
Oroboros O2k提供了一种独特的SUIT（底物-解偶联剂-抑制剂-滴定，Substrate-uncoupler-inhibitor-titration）检测方案来检测线粒体氧化磷酸化各复合体的功能活性：Oroboros O2k没有加药数量的限制，也没有试剂盒的限制，可以根据实验设计灵活的不限制的添加底物、抑制剂、解偶联剂及不同浓度的药物滴定，实现同一个样本一次性快速进行复合物I、复合物II、复合物IV、z大呼吸率、ATP合酶的功能活性检测，深度挖掘线粒体能量代谢信息，快速评估和表征线粒体氧化磷酸化各复合体功能活性，从而加速靶向线粒体氧化磷酸化药物研发的进展。
应 用 案 例：天然产物Isoplumbagin的抗癌机制研究
摘要：Isoplumbagin (5-hydroxy-3-methyl-1,4-naphthoquinone)，一种天然存在的醌，具有抗炎和抗菌活性。长期以来，炎症一直与癌症进展相关。在这项研究中，作者检查了Isoplumbagin的抗癌作用。作者的研究结果表明，Isoplumbagin抑制了口腔鳞状细胞癌 (OSCC) OC3-IV2 细胞、胶质母细胞瘤 U87 细胞、非小细胞肺癌 H1299 细胞、前列腺癌 PC3 细胞和宫颈癌 HeLa 细胞的细胞活力。体内研究表明 2 mg/kg Isoplumbagin对源自 OSCC 细胞的原位异种移植肿瘤（口腔颊）的生长有抑制作用。从机制上讲，Isoplumbagin通过降低癌细胞线粒体复合体 IV 活性，促进癌细胞发生凋亡，从而发挥其细胞毒性作用，起到抗癌的治疗效果。
实验结果：
作者直接通过奥地利Oroboros O2k进行检测研究了Isoplumbagin如何减少癌细胞线粒体 OXPHOS。Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，以谷氨酸/苹果酸为底物的复合体 I 功能活性和以琥珀酸为底物的复合体II 功能活性没有变化，但以四甲基对苯二胺 (TMPD)/抗坏血酸为底物的癌细胞复合体 IV的功能活性明显降低。综上所述，这些数据表明Isoplumbagin可通过抑制癌细胞线粒体复合体 IV 活性减少OXPHOS水平。值得注意的是，作者也尝试用另外一组药物处理方案，如图所示，分别添加Oligomycin、FCCP、Rotenone & Antimycin，做胞外呼吸能力测试，Isoplumbagin癌细胞处理组与DMSO癌细胞对照组相比，整体胞外呼吸能力有降低，但无法对癌细胞复合体IV功能活性是否存在显著性差异进行表征分析，无法进行更深入的机制研究。
