实验小技巧 | O2k多维度能量代谢分析系统检测面包酵母活性氧的产生率

背景介绍

面包酵母是一种无水生物，以其在没有水的情况下可以持续数十年而闻名。当再水合时，它可以在几分钟内迅速恢复活跃的新陈代谢。此外，干面包酵母在30至40°C再水合时具有较高的活性 [1,2]。

 

实验技巧

市售的冻干面包酵母可在磷酸钠缓冲液 (1 mL) 中水化，要获得均匀的细胞悬液，需移液枪吹打混匀20次，持续10分钟。样品加入O2k舱室之前需再次轻轻吹打混匀10次，后将20 µL的样品加入2 mL的舱室 (37°C) 中。由于细胞迅速沉积和聚集，样品在加入两个舱室之间，需再次将细胞悬液吹打混匀10次。

 

试剂

呼吸介质：MiR05

酵母原液悬浮液（20 mg/mL）：

  • 将20 mg面包酵母（活性干酵母颗粒）溶解在1 mL温呼吸培养基中[3]。

  • 移液枪缓慢吹打混匀20次，获得均匀的细胞悬液。

  • 移液枪快速吹打混匀10次，使用加样针将20（100）μL酵母悬液加入每个2ml舱室中（舱室内的最终浓度为0.2（1.0）mg/mL；在本例中使用了1.5 mg/mL）。

  • 样品在每次加入舱室前，需将混悬液再次吹打混匀10次。

 

H2O2 校准溶液（40 µM）：

（推荐试剂：Sigma-Aldrich 323381，3 %过氧化氢溶液= 880 mM）

制备步骤如下：

  • H2O2 稀释1 (1:88)：将10 µL 3 %过氧化氢溶液加入 870 µL 10 µM HCl溶液中，获得10 mM H2O2溶液。

  • H2O2 稀释2 (1:125)：在996 µL 10 µM HCl 溶液中加入4 µL 10 mM H2O2 溶液，得到40 µM H2O2溶液。

 

Amplex® UltraRed (AmR)：

  • 储存溶液= 10 mM AmR溶于DMSO。

 

辣根过氧化物酶 (HRP )：

500 U/mL HRP 溶于MiR05。

  • CCCP (U)：1 mM 储备溶液（1.02 mg溶于5 mL DMSO中）。与哺乳动物细胞或线粒体相比，完整酵母需要更高浓度的解偶联剂。

  • FCCP(U): 1 mM 原液，现已被CCCP取代。FCCP 的溶剂乙醇具有刺激酵母呼吸的缺点。DMSO作为CCCP的溶剂可避免这种情况。

 

O2k的实验设置

温度：37°C

电流 (Amp) 传感器：1000

电流传感器的极化电压：100 mV

数据记录间隔：2秒

 

试验方案

滴定试剂

（最终浓度）

试剂名称

添加量 [µL]

Yeast

(0.2 to 1.0 mg/mL)*

Yeas

20 to 100

Amplex®

UltraRed 

(10 µM)

AmR

2

Horse radish

peroxidase

(1 U/mL)

HRP

4

SOD (5 U/mL)

SOD

Variable

H2O2

 (0.1 µM steps,

 total 0.2 µM)

H2O2

5 + 5

 (two steps)

Glucose

 (20 mM)

Glc 

(2 M 

stock)

20

EtOH

EtOH 

(pure)

40

CCCP 

(5 µM steps)**

U

10+10+10+

10+..

*可通过注入纯氧气进行氧气补充。

 

结果与讨论

在图 1 所示的研究中，在缺氧和高氧条件下以及葡萄糖刺激呼吸后研究了酵母（1.5 mg/mL）的呼吸以及H2O2的产生。其呼吸的氧动力学（图 1B）与分离的线粒体非常相似但不完全相似[4]，这表明细胞外的氧气水平提供了近似细胞内的条件。细胞外底物葡萄糖和乙醇以及解偶联剂的滴定可显著刺激呼吸（图 2）。相反，这些底物对细胞外H2O2的产生影响很小（图 2）。

图 1、氧浓度（蓝线）、耗氧率（红线）和过氧化氢产量（绿线）随时间和氧气浓度变化的O2k曲线。细胞外H2O2的产生是高压氧和常氧范围内氧气浓度的线性函数[5]。

图 2、 图 1中所示实验的扩展，通过乙醇刺激呼吸和通过FCCP滴定解偶联。在没有外部底物 (R1-R3)、葡萄糖 (Glc4)、乙醇 (EtOH5和EtOH6) 和解偶联后 (FCCP7) 的不同代谢状态下的细胞外过氧化氢产生的氧依赖性。

 

参考文献

 

1. Crowe HJ, Carpenter FJ, Crowe M (1998) The role of vitrification in anhydrobiosis. Annu Rev Physiol 60:73-103.

2. Koga S, Echigo A, Nunomura K (1966) Physical properties of cell water in partially dried Saccharomyces cerevisiae. Biophys J 6:665-74.

3. Komlodi T, Sobotka O, Krumschnabel G, Bezuidenhout N, Hiller E, Doerrier C, Gnaiger E (2018) Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.Methods Mol Biol 1782:137-55. - »Bioblast link«

4. Scandurra FM, Gnaiger E (2010) Cell respiration under hypoxia: Facts and artefacts in mitochondrial oxygen kinetics. Adv Exp Med Biol 662:7-25. - »Bioblast link«

5. Boveris A, Chance B (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J 134:707-16. - »Bioblast link« 

 

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